Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Serum ve Glukokortikoid ile İndüklenebilen Kinaz 1 (SGK-1) İnhibisyonunun Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR) Aracılı Sinyal Yolağı Üzerindeki Etkisi

Abstract

Oncogenic activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling exists in non-small cell lung cancer (NSCLC). Increased expression of Serum and Glucocorticoid Inducible Kinase 1 (SGK-1) in NSCLC cells was found related to proliferation and migration. Relationship between EGFR signaling and a SGK-1 substrate, NDRG1, was also shown in pancreas and colon cancer. In this study, we analyzed the effects of SGK-1 inhibitor GSK650394 on cell proliferation and EGFR signaling in A549 and H1299 human NSCLC cell lines for the first time. Incubation with GSK650394 (8 and 16 µM) significantly decreased cell proliferation and colony formation in A549 and H1299 cells (p<0.05). This result points out that NSCLC cells need SGK-1 activity for proliferation. SGK-1 activity was sensitive to GSK650394 in NSCLC cells. Phosphorylation of NDRG1 (p<0.001) and GSK3was suppressed (p<0.01) in H1299 and A549 cells respectively. We evaluated effects of SGK-1 inhibition on EGFR signaling together with alteration in NDRG1 phosphorylation. Although significant NDRG1 phosphorylation decrease in H1299 cells, any significant change in expression and activation of EGFR wasn’t observed in both cell lines. In conclusion, possible mechanisms could be enlightened by evaluating effects on EGFR after increasing NDRG1 expression in NSCLC cells. SGK-1 inhibitors could be a remarkable alternative in combination treatments with their effects on NSCLC cell proliferation.Bu çalışma Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir (Proje Numarası: TDK-2016-13331).ONAY SAYFASI YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI ETİK BEYAN SAYFASI TEŞEKKÜR ÖZET ABSTRACT İÇİNDEKİLER SİMGELER ve KISALTMALAR ŞEKİLLER TABLOLAR 1. GİRİŞ 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Akciğer Kanseri 2.2. KHDAK Moleküler Biyolojisinde Önemli Moleküller 2.2.1. EGFR 2.2.2. KRAS 2.2.3. BRAF 2.2.4. MEK 2.2.5. HER2 2.2.6. PI3K/AKT/mTOR 2.2.7. ALK 2.2.8. MET 2.2.9. ROS1 2.2.10. RET 2.2.11. FGFR1 2.2.12. Tümör Supresör Genler 2.3. KHDAK’de EGFR Aracılı Sinyal Yolağının Önemi 2.4. Serum ve Glukokortikoid ile İndüklenebilen Kinaz -1 2.5. Enzim İnhibisyon Mekanizmaları ve SGK-1 İnhibisyonu 2.5.1. Enzim İnhibisyon Mekanizmaları 2.5.2. SGK-1 İnhibisyonu ve SGK-1 İnhibitörü GSK650394 2.6. N-myc downregulated gene 1 2.7. SGK-1/NDRG1/EGFR İlişkisi 2.8. A549 ve H1299 Hücre Dizilerinin Özellikleri 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. Kimyasal Maddeler, Kitler ve Tamponlar 3.2. Aletler ve Cihazlar 3.3. Hücre Kültürü 3.3.1. Tripsinizasyon 3.3.2. Hücre Pasajı 3.3.3. Hücre Dondurma 3.3.4. GSK650394 alikotlarının hazırlanması 3.4. MTT Assay 3.5. Kristal Viyole Assay 3.6. Western Blot Deneyleri 3.6.1. İlaç Uygulama 3.6.2. Lizat Hazırlama 3.6.3. Protein Kantitasyonu 3.6.4. Western Blot ve Protein Analizi 3.7. İstatistiksel Analiz 3.8. Etik Onay ve Araştırma Desteği 4. BULGULAR 4.1. KHDAK Hücrelerinde SGK-1 Ekspresyonunun Gösterilmesi 4.2. KHDAK Hücrelerinde GSK650394’ün Subtoksik Dozunun MTT Canlılık Testi ile Belirlenmesi 4.3. GSK650394 ‘ün KHDAK Hücrelerinin Çoğalmasına ve Koloni Oluşturmasına Etkisinin Kristal Viyole Yöntemi ile Incelenmesi 4.4. KHDAK Hücrelerinde SGK-1’in GSK650394 ile Farmakolojik İnhibisyonunun Western Blot Yöntemiyle İncelenmesi 4.4.1. GSK650394’ün NDRG1 ve p-NDRG1 Ekspresyonuna Etkisinin İncelenmesi 4.4.2. GSK650394’ün SGK-1 Ekspresyonuna Etkisinin İncelenmesi 4.4.3. GSK650394’ün p-GSK3 Ekspresyonuna Etkisinin İncelenmesi 4.4.4. GSK650394’ün EGFR Ekspresyonuna Etkisinin İncelenmesi 4.4.5. GSK650394’ün EGFR Aktivasyonuna (p-EGFR Ekspresyonuna) Etkisinin İncelenmesi 5. TARTIŞMA 6. SONUÇ ve ÖNERİLER 7. KAYNAKLAR 8. EKLER EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Etik Kurul İzinleri EK-2: Tez Çalışması Orijinallik Raporu EK-3: Turnitin Programı Ekran Görüntüsü Çıktısı 9. ÖZGEÇMİŞKüçük hücreli dışı akciğer kanserlerinde (KHDAK) epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) sinyal yolağının onkojenik aktivasyonu görülmektedir. KHDAK hücrelerinde Serum ve Glukokortikoid ile İndüklenebilen Kinaz 1’in (SGK-1) ekspresyonunun artması proliferasyon ve migrasyonla ilişkili bulunmuştur. SGK-1’in substratı olan NDRG1 proteininin, pankreas ve kolon kanserinde EGFR aracılı sinyal iletimi ile ilişkili olduğu bildirilmektedir. Bu çalışmada, A549 ve H1299 insan KHDAK hücre dizilerinde SGK-1 inhibitörü GSK650394’ün hücre proliferasyonu ve EGFR sinyal yolağı üzerine etkisi ilk kez incelendi. GSK650394 ile inkübasyonun (8 ve 16 µM), A549 ve H1299 hücrelerinde hücre çoğalması ve koloni oluşumunu anlamlı olarak azalttığı belirlendi (p<0,05). Bu sonuç KHDAK hücrelerinin proliferasyon için SGK-1 aktivitesine ihtiyaç duyduğuna işaret etmektedir. KHDAK hücre dizilerinde SGK-1 aktivitesi GSK650394 ‘e duyarlı bulundu. H1299 hücrelerinde NDRG1 fosforilasyonu inhibe olurken (p<0,001), A549 hücrelerinde GSK3’nın fosforilasyonu baskılandı (p<0,01). Çalışmamızda, SGK-1 inhibisyonunun EGFR sinyal yolağı üzerine etkisi ve bunun NDRG1 fosforilasyonundaki değişim ile ilişkisi incelendi. H1299 hücrelerinde NDRG1 fosforilasyonunun değişimine rağmen her iki hücre dizisinde de EGFR ekspresyonunda ve aktivasyonunda anlamlı değişiklik izlenmedi. Sonuç olarak, KHDAK hücrelerinde NDRG1 ekspresyon düzeyi artırılarak, EGFR sinyal yolağı üzerindeki etkinin incelenmesinin mekanizmaya ışık tutabileceği düşünülmektedir. KHDAK hücrelerinin proliferasyon için SGK-1 aktivitesine ihtiyaç duymaları, SGK-1 inhibitörlerini kombinasyon tedavilerinde dikkate değer bir seçenek yapmaktadır