Poli(Bütilenadipat-ko-Tereftalat) (PBAT) Mikro ve Nanopartiküller: Sentez, Karakterizasyon ve Kurkumin Salım Kinetiğinin İncelenmesi

Abstract

This study was performed with the support of ‘Poly(butylene adipate-coterephthalate) (PBAT) Micro and Nanoparticles: Synthesis, Characterization and Investigation of Curcumin Release Kinetics’ entitled and FHD-2016-11953 coded Hacettepe University funding project and TÜBİTAK 2210-C Primary Subject National Scholarship Program for MSc Students. In the scope of the thesis, the efficiency of aliphatic-aromatic copolyester poly(butylene adipate-co-terephthalate) (PBAT) in drug release applications was investigated. For this purpose, after the synthesis and characterization of PBAT micro and nanoparticles the loading and in-vitro release of curcumin that is recently prominent as a natural, anticancerogenic drug was achieved and the cytotoxic effect of the particles was determined in the cell culture systems.ÖZET ....................................................................................................................... İ ABSTRACT ........................................................................................................... İİİ TEŞEKKÜR ............................................................................................................ V İÇİNDEKİLER ....................................................................................................... Vİİ ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................. Xİ ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................. Xİİ SİMGELER VE KISALTMALAR .......................................................................... XVİ 1. GİRİŞ .............................................................................................................. 1 2. GENEL BİLGİLER ........................................................................................... 3 2.1. Kontrollü Salım Sistemleri ............................................................................ 3 2.2. Partiküler Formdaki İlaç Salım Sistemleri .................................................... 6 2.2.1. Mikropartiküller ............................................................................................ 7 2.2.2. Nanopartiküller ............................................................................................ 8 2.2.3. Partikül Üretim Yöntemleri ........................................................................... 9 2.3. Kontrollü İlaç Salım Sistemlerinde Kullanılan Matematiksel Modeller ........ 13 2.4. İlaç Salım Sistemlerinde Kullanılan Biyomalzemeler ................................. 15 2.4.1. Sentetik Polimerler..................................................................................... 15 2.4.2. Doğal Polimerler ........................................................................................ 16 viii 2.5. Poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT) ..................................................... 17 2.5.1. PBAT’ın Özellikleri ve Kullanım Alanları .................................................... 18 2.5.2. PBAT’ın Biyouyumluluğu ve Biyobozunurluğu ........................................... 20 2.5.3. PBAT’ın İlaç Salım Sistemlerinde Kullanımı .............................................. 22 2.6. Kurkumin ................................................................................................... 23 2.6.1. Kurkuminin İlaç Salım Sistemlerinde Kullanımı ......................................... 25 2.6.2. Kurkuminin Antikanserojen Etkisi .............................................................. 27 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR ........................................................................... 30 3.1. Kullanılan Malzemeler ............................................................................... 30 3.2. PBAT Mikro ve Nanopartiküllerin Üretimi ................................................... 31 3.2.1. Kurkumin Yüklü Olmayan PBAT Mikro ve Nanopartiküllerin Üretimi ......... 31 3.2.2. Kurkumin Yüklü PBAT Mikro ve Nanopartiküllerin Üretimi ......................... 32 3.3. Karakterizasyon Çalışmaları ...................................................................... 33 3.3.1. Partikül Boyutunun Belirlenmesi ................................................................ 33 3.3.1.1. Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) Analizi ........................................... 33 3.3.1.2. Dinamik Işık Saçılım (DLS) Analizi ......................................................... 33 3.3.2. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) Analizi .................................................. 33 3.3.3. Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) Analizi ...................... 34 3.3.4. Termogravimetrik-Diferensiyal Termal Analiz (TG-DTA) ........................... 34 3.3.5. X Işını Kırınımı (XRD) Analizi .................................................................... 34 3.4. Kurkumin Yüklü PBAT Mikro ve Nanopartiküllerin Enkapsülasyon Verimlerinin Belirlenmesi ...................................................................................... 34 ix 3.5. İn-vitro Kurkumin Salım Deneyleri ............................................................. 35 3.6. Hücre Kültür Çalışmaları ............................................................................ 36 3.6.1. İnhibitör Konsantrasyonunun Belirlenmesi ................................................. 37 3.6.1.1. Kurkuminin İnhibitör Konsantrasyonunun Belirlenmesi .......................... 37 3.6.1.2. Kurkumin Yüklü PBAT Nanopartiküllerin İnhibitör Konsantrasyonunun Belirlenmesi .......................................................................................................... 38 3.6.1.3. Optik Mikroskop ile Analiz ...................................................................... 39 3.6.2. Sitotoksisite Analizleri ................................................................................ 39 3.6.2.1. MTT Analizi ............................................................................................ 39 3.6.2.2. Canlı-Ölü Hücre Analizi .......................................................................... 40 3.6.2.3. Hücre Canlılığı ve Morfolojisinin Görüntülenmesi .................................. 40 3.6.3. Hücre Döngü Analizi .................................................................................. 41 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA ......................................................................... 43 4.1. PBAT Partiküllerin Karakterizasyon Çalışmaları ........................................ 44 4.1.1. Partikül Boyutunun Belirlenmesi ................................................................ 44 4.1.1.1. Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) Analizi ........................................... 47 4.1.1.2. Dinamik Işık Saçılım Analizi ................................................................... 52 4.1.2. Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) Analizi ...................... 54 4.1.3. Termogravimetrik-Diferensiyal Termal Analiz (TG-DTA) ........................... 55 4.1.4. X Işını Kırınımı (XRD) Analizi .................................................................... 57 4.1.5. Kurkumin Yüklü PBAT Mikro ve Nanopartiküllerin Enkapsülasyon Verimlerinin Hesaplanması................................................................................... 58 x 4.2. Kurkumin Yüklü PBAT Mikro ve Nanopartiküllerden Kurkumin Salım Çalışmaları ve Salım Kinetiklerinin İncelenmesi ................................................... 59 4.3. Hücre Kültür Çalışmaları ............................................................................ 61 4.3.1. İnhibitör Konsantrasyonunun Belirlenmesi ................................................. 62 4.3.1.1. Kurkuminin İnhibitör Konsantrasyonunun Belirlenmesi .......................... 62 4.3.1.2. Optik Mikroskop Analizi .......................................................................... 67 4.3.1.3. Kurkumin Yüklü PBAT Nanopartiküllerin İnhibitör Konsantrasyonunun Belirlenmesi .......................................................................................................... 69 4.3.2. Sitotoksisite Analizleri ................................................................................ 72 4.3.2.1. MTT Analizi ............................................................................................ 72 4.3.2.2. Optik Mikroskop Analizi .......................................................................... 75 4.2.1.1. Hücre Canlılığı ve Morfolojisinin Görüntülenmesi .................................. 76 4.3.3. Canlı-Ölü Analizi ........................................................................................ 82 4.3.4. Hücre Döngü Analizi .................................................................................. 88 5. GENEL SONUÇLAR ..................................................................................... 91 KAYNAKLAR ........................................................................................................ 94 EKLER ............................................................................................................... 111 EK-1 ................................................................................................................... 111 EK-2 ................................................................................................................... 112 ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 113Bu tez çalışması “Poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT) Mikro ve Nanopartiküller: Sentez, Karakterizasyon ve Kurkumin Salım Kinetiğinin İncelenmesi” adlı ve FHD- 2016-11953 kodlu Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi ve 2210-C TÜBİTAK Öncelikli Alanlara Yönelik Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı desteği ile gerçekleştirilmiştir. Tez kapsamında, alifatik-aromatik bir kopoliester olan poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT)’ın ilaç salım sistemlerindeki etkinliğinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla PBAT mikro ve nanopartiküllerin sentez ve karakterizasyonlarının ardından doğal, antikanserojen nitelikli bir ilaç olarak son yıllarda öne çıkan kurkuminin partiküllere yüklenmesi ile in-vitro salımı gerçekleştirilmiş ve partiküllerin hücre kültür sistemlerindeki sitotoksik etkisi belirlenmiştir. İlk basamakta, kurkumin yüklü olmayan PBAT partiküller sentezlenmiştir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda en uygun morfolojik özellikteki mikro ve nano boyutta iki farklı partikül seçilmiştir ve çalışmanın diğer kısımlarında bu partiküller kullanılmıştır. Bu partiküllerden %1 PBAT (w/v), %1 poli(vinil alkol) (PVA) (w/v) ile hazırlanan partiküller mikro boyutu; %1 PBAT (w/v), %1.5 ii didodesildimetilamonyum bromür (DMAB) (w/v) ile hazırlanan partiküller ise nano boyutu temsil etmektedir. Elde edilen PBAT mikro ve nanopartiküllerin boyutları sırasıyla 1.05 ± 0.53 m ve 0.38 ± 0.18 m’dir. Ardından PBAT mikro ve nanopartiküllere kurkumin yüklemesi gerçekleştirilmiştir. PBAT mikro ve nanopartiküllerin en yüksek kurkumin enkapsülasyon verimleri PBAT ve kurkuminin kütlece oranının 10 kat olduğu durumda sırasıyla % 80 ± 5 ve % 90 ± 3 olarak belirlenmiştir. Kurkumin yüklü olan ve olmayan PBAT mikro ve nanopartiküllerin karakterizasyon çalışmaları ile kimyasal ve termal özellikleri ayrıntılı olarak belirlenmiş ve kurkuminin yapıdaki varlığı kanıtlanmıştır. Devam eden basamakta kurkumin yüklü PBAT mikro ve nanopartiküllerin in-vitro salım çalışmaları yapılmış ve kurkumin salım kinetikleri incelenmiştir. Salım çalışmalarına göre kurkumin yüklü PBAT mikro ve nanopartiküllerden kurkuminin 22 günde sırasıyla %49 ve %73 oranında salındığı belirlenmiştir. Mikropartiküller ile kurkumin salımının nanopartiküllere göre daha yavaş gerçekleştiği görülmüştür. Partiküllerin kurkumin salım kinetikleri incelendiğinde ise her iki tip partikülden kurkumin salımının Higuchi salım kinetik modeline uyduğu belirlenmiştir. Son basamakta ise hücre kültürü çalışmaları ile MG-63 insan kemik kanseri hücrelerinin ve MC3T3-E1 fare kemik öncül hücrelerinin tek tabaka kültürleri üzerinde kurkumin yüklü olan ve olmayan PBAT mikro ve nanopartiküllerin sitotoksik etkileri incelenmiştir. Hücrelerin canlılığı ve üremesi MTT (3-[4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analiziyle, hücre morfolojileri ise optik mikroskop ve floresan mikroskop görüntüleri ile takip edilmiştir. Partiküllerin MG-63 hücrelerini inhibe ettiği ve MC3T3-E1 hücreleri üzerinde sitotoksik bir etkiye neden olmadığı belirlenmiştir. Kurkuminin antikanserojen özelliğinin hücre döngüsündeki etkisi ise akış sitometre ile analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre kurkuminin MG-63 hücrelerini G0/G1 hücre döngü fazında inhibe ettiği ve MC3T3-E1 hücreleri üzerinde anlamlı bir etkiye neden olmadığı belirlenmiştir.Bu tez çalışması “Poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT) Mikro ve Nanopartiküller: Sentez, Karakterizasyon ve Kurkumin Salım Kinetiğinin İncelenmesi” adlı ve FHD- 2016-11953 kodlu Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi ve 2210-C TÜBİTAK Öncelikli Alanlara Yönelik Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı desteği ile gerçekleştirilmiştir. Tez kapsamında, alifatik-aromatik bir kopoliester olan poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT)’ın ilaç salım sistemlerindeki etkinliğinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla PBAT mikro ve nanopartiküllerin sentez ve karakterizasyonlarının ardından doğal, antikanserojen nitelikli bir ilaç olarak son yıllarda öne çıkan kurkuminin partiküllere yüklenmesi ile in-vitro salımı gerçekleştirilmiş ve partiküllerin hücre kültür sistemlerindeki sitotoksik etkisi belirlenmiştir