PREPARATION OF MONOLITHIC AFFINITY COLUMNS FOR OCHRATOXIN A DETERMINATION AND INVESTIGATION OF ONLINE ANALYSES IN THE TWO-DIMENSIONAL HPLC SYSTEMS

Abstract

The aim of this thesis is the preparation of monolithic affinity columns and simultaneous determination of Ochratoxin A (OTA) in food by assessing tolerable levels for humans with two-dimensional HPLC (2D-HPLC) system. It was aimed to combine the hot topics of recent researches such as monolithic columns, multidimensional chromatographic techniques and mycotoxin analysis in foodstuffs. Hydrophobic affinity-based monolithic columns were designed in steel HPLC columns to create alternative columns for disposable OTA immunoaffinity columns on the market. First, the N-methacryloyl-L-phenylalanine (MAPA) monomer which is polymerizable derivative of the L-phenylalanine molecule used as the hydrophobic ligand, was synthesized. Monolithic columns were synthesized by the bulk polymerization of MAPA and 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) conducted in a steel HPLC column at 75°C (temperature controlled water bath) for 3.5 h. Monolithic columns are characterized by scanning electron microscopy (SEM), elemental analysis, Fourier transform infrared-attenuated total reflectance spectroscopy (FTIR-ATR), Raman spectroscopy and back pressure-flow rate dynamics. In the first step, optimization of the analysis conditions for OTA with the monolithic affinity columns prepared was studied in a one-dimensional HPLC (1D-HPLC) system. In this context, OTA concentrations (0.5-20 ng/mL), MAPA monomer content (0-250 μmol), mobile phase [ACN:H2O (containing 2% HAc) (40:60-45:55-51:49-55:60)], flow rate (0.25-1.5 mL/min), temperature (25°C-40°C) and injection volume (10-100 μL) were investigated. In the second step of the study, two different columns in the first dimension hydrophobic based monolithic columns as separation column and in the second dimension reverse phase C18 column as analytical column were integrated into HPLC system. OTA in foodstuffs (beer, wine, corn and coffee) was simultaneously analyzed in a two-dimensional HPLC system. The intra-day RSD% were varied from 0.21%-0.49% with recoveries obtained varying between 104.44% and 107.33% whereas the inter-day RSD% were varied from 0.44%-1.31% with recoveries found to be 104.34%-107.03% to the concentration of OTA at 2-5 ng/mL. It has been demonstrated that monolithic columns could be used for OTA analysis to alternative single-use disposable immunoaffinity columns on the market, which can be used repeatedly without significant loss in intra-day and inter-day reusability values.1002 Hızlı Destek kapsamında 114Z708 numaralı proje ile TÜBİTAKSunulan tez kapsamında, besinlerdeki Okratoksin A (OTA) seviyelerinin insan sağlığı açısından tolere edilebilir düzeyde olup olmadığını gözlemleyebilmek için OTA tayinine yönelik monolitik afinite kolonlarının hazırlanması ve eş zamanlı olarak analizlerin iki-boyutlu HPLC (2D-HPLC) sisteminde incelenmesi hedeflenmiştir. Çalışmada son yılların gözde araştırma konuları olan monolitik kolonlar, çok-boyutlu kromatografik teknikler ve gıda maddelerindeki mikotoksin analizi konularının birleştirilmesi amaçlanmıştır. Piyasadaki Okratoksin A immünoafinite kolonlarına alternatif kolonlar oluşturmak için çelik HPLC kolonlarında hidrofobik afinite temelli monolitik kolonlar tasarlanmıştır. Bu doğrultuda, ilk olarak hidrofobik ligand olarak kullanılan L-fenilalanin molekülünün polimerleşebilen türevi olan N-metakriloil-L-fenilalanin (MAPA) monomeri sentezlenmiştir. Monolitik kolonlar, MAPA monomeri ile 2-hidroksietil metakrilat (HEMA)’ın yığın polimerizasyonu ile çelik kolonların içerisinde 75°C'lik su banyosunda 3.5 saatte sentezlenmiştir. Monolitik kolonlar, taramalı elektron mikroskobu (SEM), elementel analiz, Fourier dönüşümlü toplam yansıması azaltılmış infrared spektroskopisi (FTIR-ATR), Raman spektroskopisi ve geri basınç-akış hızı ilişkisi yöntemleri ile karakterize edilmiştir. İlk aşamada, hazırlanan monolitik afinite kolonları ile okratoksin A analiz koşullarının optimizasyonu tek-boyutlu HPLC (1D-HPLC) sisteminde incelenmiştir. Optimizasyon çalışmaları kapsamında; OTA derişimi (0.5-20 ng/mL), MAPA monomer miktarı (0-250 µmol), hareketli faz [ACN:H2O (% 2 HAc içeren) (40:60-45:55-51:49-55:45-60:40)], akış hızı (0.25-1.5 mL/dk), sıcaklık (25°C-40°C) ve enjeksiyon hacmi (10-100 µL) etkileri incelenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında ise hidrofobik temelli monolitik kolonlar birinci boyutta ayrıma kolonu olarak, ters faz C18 kolonu ise ikinci boyutda analitik kolon olarak HPLC sistemine entegre edilmiştir. Gıda maddelerindeki (bira, şarap, mısır ve kahve) OTA eş zamanlı olarak iki-boyutlu HPLC sisteminde analiz edilmiştir. 2-5 ng/mL OTA çözeltileri için gün içi tekrar kullanılabilirlik % RSD değerleri % 0.21-% 0.49 ve % geri kazanım değerleri % 104.44-% 107.33 olarak; günler arası tekrar kullanılabilirlik % RSD değerleri ise % 0.44-% 1.31 ve % geri kazanım değerleri de % 104.34-% 107.03 olarak bulunmuştur. Monolitik kolonların gün içi ve günler arası tekrar kullanılabilirlik değerlerinde belirgin bir azalma olmadan defalarca kullanılabileceği ve bu yüzden piyasada OTA’nın analizinde kullanılan tek kullanımlık immünoafinite kolonlarına alternatif olabileceği kanıtlanmıştır