The Directive of the EU 495/2015 concerning the list of pesticides, the monitoring of which is necessary in the estimation of ecological water quality, includes neonicotinoids, as well. By the LC-MS/MS analysis of the samples from the Danube the residues of thiamethoxam, acetamiprid and imidacloprid were detected. The detection of insecticides from the neonicotinoid group points at the necessity of the implementation of the Directive in the water quality monitoring.Direktiva EU 495/2015 na listu pesticida čije praćnje je neophodno u proceni ekološkog kvalitata voda, uključuje i neonikotinoide. LC-MS/MS analizom uzoraka Dunava, detektovani su ostaci tiametoksama, acetamiprida i imidakloprida. Detektovanjem insekticida iz grupe neonikotinoida, ukazuje se na potrebu implementacije ove direktive pri praćenju kvaliteta vode

Bursic, Vojislava

Gvozdenac, Sonja

Meseldzija, Maja

Petrovic, Aleksandra

Stojanovic, Zoran

Vukovic, Gorica

Zeremski, Tijana

Croatian

CaSA NaRA

“XXI  SAVETOVANJE  O  BIOTEHNOLOGIJI”                      Zbornik radova, Vol. 21.(23), 2016. 359  IMPLEMENTACIJA DIREKTIVE EU 495/2015 U PRAĆENJU KVALITETA VODE DUNAVA  Vojislava Bursić1, Gorica Vuković2, Zoran Stojanović3, Sonja Gvozdenac1, Tijana Zeremski4, Maja Meseldžija1, Aleksandra Petrović1   Izvod: Direktiva EU 495/2015 na listu pesticida čije praćnje je neophodno u proceni ekološkog kvalitata voda, uključuje i neonikotinoide. LC-MS/MS analizom uzoraka Dunava, detektovani su ostaci tiametoksama, acetamiprida i imidakloprida. Detektovanjem insekticida iz grupe neonikotinoida, ukazuje se na potrebu implementacije ove direktive pri praćenju kvaliteta vode.  Ključne reči: voda, Dunav, EU Direktive, neonikotinoidi, LC-MS/MS  Uvod  Problem zagađenja Dunava u pojedinim podunavskim zemljama postao je glavna tema rasprave brojnih naučnika i stručnjaka iz oblasti zaštite životne sredine. Nažalost, ovaj problem uočen je relativno kasno (krajem osamdesetih godina dvadesetog veka), nakon što su hemikalije u vodi izazvale nestanak mnogih akvatičnih organizama (Mladenović-Ranisavljević et al., 2012). Posebna pažnje je posvećena pesticidima koji mogu migrirati u površinske i podzemne vode, nakon aplikacije na biljke ili zemljište (Ismail et al., 2012). Neretko, poljoprivredni proizvođači nakon završenog prskanja, bacaju praznu ambalažu u lokalne kanale ili ih ostavljaju pored njive, što predstavlja još jedan izvor zagađenja (Bursić et al., 2013). Iako se pesticidi smatraju izuzetno toksičnim supstancama u životnoj sredini, veoma je malo informacija o njihovoj distribuciji i upotrebi u Srbiji (Antić et al., 2013).  U Evropskoj uniji prisustvo pesticida u vodi je regulisano različitim direktivama, poput Direktive 2006/118/EC koja se odnosi na zagađenje podzemnih voda. Direktiva 98/83/EC je u vezi sa kvalitetom vode namenjenoj ljudskoj upotrebi. Direktiva 2000/60/EC postavlja osnovu za zajedničko delovanje na polju politike vode (Water Framework Directive – WFD). WFD ima za cilj postizanje „dobrog hemijskog i ekološkog statusa u svim vodama” do 2020. godine. Okvirna direktiva o vodama Evropske unije (Water Framework Directive 2000/60/EC) predstavlja pravni okvir za zaštitu i poboljšanje kvaliteta svih vodnih resursa poput reka, jezera, podzemnih, priobalskih voda i drugih u Evropskoj uniji. Stupila je na snagu u decembru 2000. godine, prema kojoj su zemlje članice EU bile u obavezi da je inkorporiraju u svoje nacionalno zakonodavstvo do kraja 2003. godine. Od tada, neophodno je bilo sprovoditi aktivnosti u cilju postizanja željenog „dobrog stanja” svih voda u Evropskoj uniji do                                                  1Univerzitet u Novom Sadu, Poljoprivredni fakultet, Trg Dositeja Obradovića 8, Srbija (bursicv@polj.uns.ac.rs); 2Gorica Vuković,  Nebojša Vuković, Gradski zavod za javno zdravlje Beograd, Bulevar despota Stefana 54a, Beograd, Srbija; 3Republički hidrometeorolški zavod, Beograd; 4Institut za ratarstvo i povrtarstvo, Maksima Gorkog 30, 21 000 Novi Sad. “XXI  SAVETOVANJE  O  BIOTEHNOLOGIJI”                      Zbornik radova, Vol. 21.(23), 2016. 360  kraja 2015. godine. To je naročito istaknuto činjenicom da se vode u Evropi suočavanju sa ovim problemima radi dobrobiti kako sadašnjih, tako i budućih generacija. Formirana je indikativna lista glavnih zagađivača: organohlorna jedinjenja i supstance koje mogu formirati takva jedinjenja u vodenoj sredini, organofosfati i drugi biocidi. Direktiva 2008/105/EC kao nastavak WFD-a postavilja ekološke standard za 41 opasnu supstancu u površinskim vodama, uključujući i pesticide definisane Aneks-om X. Anex X obuhvata listu prioritetnih supstanci koje je potrebno pratiti u politici vode,  koja obuhvata 33 zagađivača od kojih su 14 pesticidi (atrazin i njegovi metaboliti, izoproturon, simazin,… ). Za pesticide koji nisu obuhvaćeni ovim anekslom, propisana je MCA (maximum allowable concentration) od 0.1 μg/L (ukupno 0.5 μg/L). Najnovija Direktiva koja je stupila na snagu u martu prošle godine, Direktiva EU 2015/495 proširuje listu pesticida koji se moraju pratiti u vodi. Ovom direktivom utvrđene su dodatne prioritetne materije: oksadiazon (88 µg L-1), metiokarb (10 µg L-1) i neonikotinoidi (9 µg L-1). Prema smernicama Direktive (EU) 2015/495 takozvane „Watch list” u vodi je neophodna kontrola insekticida iz grupe neonikotinoida. Neonikotinoidi su insekticidi novijeg datuma i u njih se ubrajaju imidakloprid, tiametoksam, acetamiprid, tiakloprid i klotianidin, kao i metabolit 6-hlor nikotinska kiselina. U našem radu će biti analizirana voda iz Dunava sa dva lokaliteta u Novom Sadu, na sadržaj neonikotinoida, tečnom hromatografijom sa tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) uz atrazin-D5, izoproturon–D6 i karbofuran–D3 koji su korišćeni kao interni standardi.  Materijal i metode rada   Uzorkovanje. Uzorci za analizu vode uzeti su iz Dunava na dva lokaliteta u Novom Sadu (45°15'59.0''N 19°51'51.0''E i 45°26'63.85''N 19°86'41.61''E) van zone direktnog uticaja uliva otpadnih voda i pritoka, a u skladu sa smernicama za uzimanje uzoraka površinskih voda iz reka i potoka SRPS ISO 5667-6. Uzorkovanje je izvedeno 27.08., 03.09., 10.09. i 17.09.2015. godine. Voda je uzimana (500 mL) iz čamca od nizvodnog toka ka uzvodnom, bez hvatanja sedimenata.  Hemikalije i aparatura. Analitički standardi tiametoksama, acetamiprida i imidakloprida (Dr Erhnerstorfer), analitički standard atrazina-D5,  izoproturona–D6,  karbofurana–D3 (Pestanal, Fluka (Nemačka)), kao IS (interni standardi) masene koncentracije 1 µg mL-1, metanol, HPLC čistoće (J.T. Baker, Holland), Dejonizovana voda, Azot 99,999% čistoće (Messer), Supelco manifold, OASIS HLB, 6 cc (Waters Corporation, USA), najlonski membranski filteri za špriceve, Econofilter (Agilent Technology), špricevi od 5 mL (Memina Krepost, Bulgaria), menzura od 250 mL.  Validacioni parametri. Prinos ekstrakcije je proveren za nivoe obogaćenja od 20, 100 i 200 ng L-1 u tri ponavljanja uz dodavanje 100 µL IS. Ispitivane koncentracije su postignute dodavanjem određene zapremine radnog rastvora masene koncentracije 10 µg mL-1 u 250 mL česmenske vode. Linearnost odziva detektora. Provera linearnosti odziva detektora urađena je za interval masenih koncentracija od 0.01 do 1.0 µg mL-1, tako što se u upareni ekstrakt (1 mL) dodavanje po 100 µL IS, a u zavisnosti od krajnje željene koncentracije se dodaje radni rastvor u količini od 200, 100, 50 i 20 µL i do “XXI  SAVETOVANJE  O  BIOTEHNOLOGIJI”                      Zbornik radova, Vol. 21.(23), 2016. 361  1000 µL dopunjenih mobilnom fazom. Limit detekcije (LOD) i limit kvantifikacije (LOQ). LOQ su zadate na osnovu regulative i eksperimentalnim putem potvrđene, obogaćivanjem kontrolnog uzorka vode smešom standarda pesticide, tako da krajnja masena koncentracija bude 0.01 µg L-1. Softverskim putem je izračunat odnos signal/šum u dobijenim hromatogramima za LOQ, a matematičkim putem su izračunate LOD vrednosti. Ekstrakcija pesticida. Ekstrakcija pesticida iz uzoraka vode izvedena je metodom Milutinović i sar. (2012) na OASIS HLB kolonama, koje su aktivirane propuštanjem 5 mL metanola, a zatim 5 mL vode. Nakon kondicioniranja, propušteno je 250 mL uzoraka vode u koju je dodato po 100 µL svakog IS. Eluiranje analita je izvršeno propuštanjem 5 mL metanola. Ekstrakti su zatim upareni u struji azota i rastvoreni u mobilnoj fazi. Uslovi hromatografskog razdvajanja. Prilikom analize vode korišćena je LC-MS/MS sa tabelarno prikazanim uslovima razdvajanja.  Tabela 1: Uslovi hromatografskog određivanja Table 1. Terms of chromatographic determination Instrument Agilent 6410B QQQ Kolona XBridge C18, 150 x 3,0 mm, 3.5 µm, Waters Jonski izvor Multimod, MMI Tip jonizacije +ESI Drying gas flow/drying gas temp. 5 ml/min./325°C Vaporizer temp. / Nebulizer gas 220°C/48 psi Opseg merenja mase m/z 70-2000 Napon kapilare 2000 V Autosampler h-ALS-SLT, model G1367D Zapremina injektovanja uzorka Vinj=10µl Tip injektovanja Sa ispiranjem/Bin/Pump-SL, model G1312B Odnos mobilnih faza V/V 50/50 Protok 0.5 ml/min Mobilna faza A:0.1% HCOOH u MeOH; B:0.1% HCOOH u vodi Odnos mobilne faze A:B=70:30 Termostat i temp. kolone Column-SL, Model G1316B, 40°C  Rezultati istraživanja i diskusija  Pre nego što se pristupi kalibraciji i kvantifikaciji pesticida, neophodno je postaviti akvizicione parametre masenog spektrometra - odrediti reakcije za praćenje jona (MRM) i naći energiju kolizione ćelije (CE), energiju fragmentacije (Frg) pri kojoj će odgovor ispitivanog pesticida biti najveći za date uslove. “XXI  SAVETOVANJE  O  BIOTEHNOLOGIJI”                      Zbornik radova, Vol. 21.(23), 2016. 362   Tabela 2: MRM prelazi (m/z) sa retencionim vremenima ispitivanih pesticida Table 2. MRM gaps (m/z) with retention times of tasted pesticides Pesticid Formula M (g/mol) Prekursor jon Produkt jon Rt (min) Izoproturon-D6 C12H18N2O 206.28 207.0 165.0 11.72    207.0 72.0  Carbofuran-D3 C12H12D3NO3 224.27 225.1 165 14.08    225.1 123  Atrazin-D5 C8H8D5CIN5 220.71 216.0 174.0 10.29    216.0 96.0  Tiametoksam C8H10CIN5O3S 291.71 292 211 9.23   292 181  Imidakloprid C9H10CIN5O2 255.66 256 208.7 3.30    256 174.6  Acetamiprid C10H11CIN4 222.67 223.1 125.8 11.45    223.1 55.7   Prema Sanco Regulativi No 12571/2013, odstupanje internih standarda u uzorcima ne sme da prelazi 20%, u našem slučaju je ispunjen ovaj zahtev uzimajući u obzir da odstupanja korišćenih IS u proseku, ne prelaze 17.5%.  Parametri validacije  Kalibraciona kriva, LOD i LOQ. Hromatografsko snimanje kontrolnog uzorka vode, korišćenog za kalibraciju i proveru prinosa ekstrakcije je urađeno kako bi se potvrdilo odsustvo pesticida u njemu. Kalibraciona kriva „matrix-matched” standarda je obuhvatila pet koncentracionih nivoa u intervalu od 0.01-1.0 μg mL-1. Postignuta je linearnost sa koeficijenton korelacije (R2) višim od 0.99 za sve ispitivane pesticide. Validacioni parametri sa niskim LOQ od 0.01 µg L-1 potvrđuju da je metoda primenjiva za određivanje ostataka pesticida u vodi u skladu sa EU Regulativama.  Prinos ekstrakcije. Provera prinosa ekstrakcije je izvedena obogaćivanjem česmenske vode na tri koncentraciona nivoa u tri ponavljanja uz dodavanje IS. Prosečani prinosi ekstrakcije ispitivanih pesticida su se kretali u intervalu od 78.4 do 123.5% sa RSD< 20% što je u skladu sa smernicama SANCO 12571/2013 dokumenta.   Analiza realnih uzoraka vode. Validovanom LC-MS/MS metodom određivanja ostataka pesticida u vodi, urađena je analiza uzoraka vode iz Dunava sa dva lokaliteta u Novom Sadu (45°15'59.0''N 19°51'51.0''E i 45°26'63.85''N 19°86'41.61''E). LC-MS/MS analiza uzoraka vode Dunava, detektovala je imidakloprid u svim uzorcima.       “XXI  SAVETOVANJE  O  BIOTEHNOLOGIJI”                      Zbornik radova, Vol. 21.(23), 2016. 363   Slika 3. Detekcije imidakloprida u svim analiziranim uzorcima Graph 3. Dection of imidaclopride in all analyzed samples  Nakon izvršene kvantifikacije pesticida, preračunete su koncentracije detektovanih neonikotinoida u uzorcima vode Dunava (µg/L). Nađene su niske koncentracije neonikotinoida, u okviru propisanih vrednosti Direktive EU 495/2015.   Tabela 3. Detektovani ostaci pesticide u analiziranim uzorcima vode Dunava (µg L-1) Table 3. Pesticide residue detected in analyzed samples of Danube wather  (µg L-1) Pesticid Uzorak 1 Uzorak 2 Uzorak 3 Uzorak 4 Uzorak 5 Uzorak 6 Uzorak 7 Uzorak 8 Tiametoksam 0.032 0.026 0.030 0.024 0.027 0.023 0.025 0.022 Imidakloprid 0.013 0.012 0.012 0.012 0.011 0.011 0.011 0.011 Acetamiprid 0.004 0.003 0.003 0.004 0.003 0.003 0.003 0.003     *Uzorci 1, 3, 5 i 7 su uzorkovani sa lokaliteta 45°26'63.85''N 19°86'41.61''E, dok su 2, 4, 6 i 8 sa 45°15'59.0''N  19°51'51.0''E     “XXI  SAVETOVANJE  O  BIOTEHNOLOGIJI”                      Zbornik radova, Vol. 21.(23), 2016. 364  Zaključak  Direktiva EU 495/2015 proširuje standarde koji se odnose na kvalitet životne sredine u oblate zaštite površinskih voda, uključujući, pored ostalih pesticida, grupu neonikotinoidnih insekticida. LC-MS/MS analiza uzoraka vode Dunava, detektovala je veoma niske koncentracije imidakloprida, tiametoksama i acetamiprida u svim uzorcima. Rezultati rada ukazuju na potrebe stalnog monitoringa površinskih voda, pogotovo ukoliko će se vode koristiti za rekreaciju i navodnjavanje poljoprivrednih proizvoda.  Napomena  Istraživanja u ovom radu deo su projekta TR 43005, koji finansira Ministarstvo prosvete i nauke Republike Srbije.  Literatura  Antić N., Radišić M., Radović T., Vasiljević T., Grujić S., Petković A., Dimkić M., Laušević M. (2013). Pesticide residues in the Danube River Basin in Serbia–a survey in 2009–2011, CLEAN – Soil, Air, Water, 43 (2), 197–204. Bursić V., Gvozdenac S., Vuković G., Pucarević M., Lazić S., Vuković S., Zeremski T., Inđić D. (2013). Comparative study of pesticide residue levels in water from irrigation canal with LC-MS/MS and biological methods, 3rd International Conference of Ecology “Essays on Ecosystem and Environmental Research”, May 31- June 5.2013. Tirana, Albania, Proceeding book, 870-874. European Union, Directive 2015/495/EC of the European Parliament and of the Council, Official Journal of the European Communities, L348. Ismail B. S., Siti Humaira Haron, Mohd. Talib Latif (2012). Pеsticide рesidue levels in тhe surface water of the irrigation canals in the muda irrigation Scheme Kedah, Malaysia, International Journal of Basic & Applied Sciences IJBAS, 12, 6, 85-90. Milutinović V., Vuković G., Matović V., Špirović B. (2012). Liquid chromatography tandem mass spectrometry for the determination of pesticide residues in surface water on the territory of Belgrade, Annual MGPR Meeting: Moving towards a sustainable agriculture, Belgrade, Serbia 11-12 October, Book of Abstracts, pp: 74. Mladenović-Ranisavljević I., Takić Lј., Vuković M., Nikolić D., Živković N., Milosavljević P. (2012). Multi-criteria ranking of the Danube water quality on its course through Serbia. Serbian J Manag 7(2): 299–307. SANCO 12571/2013. Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed.          “XXI  SAVETOVANJE  O  BIOTEHNOLOGIJI”                      Zbornik radova, Vol. 21.(23), 2016. 365  IMPLEMENTATION OF EU DIRECTIVE 495/2015 IN DANUBE WATER MONITORING   Vojislava Bursić, Gorica Vuković, Zoran Stojanović, Sonja Gvozdenac,  Tijana Zeremski, Maja Meseldžija, Aleksandra Petrović   Abstract  The Directive of the EU 495/2015 concerning the list of pesticides, the monitoring of which is necessary in the estimation of ecological water quality, includes neonicotinoids, as well. By the LC-MS/MS analysis of the samples from the Danube the residues of thiamethoxam, acetamiprid and imidacloprid were detected. The detection of insecticides from the neonicotinoid group points at the necessity of the implementation of the Directive in the water quality monitoring.  Key words: water, Danube, EU Directives, neonicotinoides, LC-MS/MS                              

Implementacija direktive EU 495/2015 u praćenju kvaliteta vode Dunava

http://arhiva.nara.ac.rs/bitstream/handle/123456789/1579/SoB_2016_Bursic%20i%20sar.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Implementacija direktive EU 495/2015 u praćenju kvaliteta vode Dunava

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

CaSA NaRA