Clinical and immunological characterization of naturally occurring canine lymphoma : development and application of engineered recombinant antibodies for diagnosis and treatment

Abstract

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Sanidade AnimalNon-Hodgkin lymphoma (NHL) is one of the most common causes of cancer-related death worldwide. Although the outcome of NHL patients has improved with current therapies, the rate of mortality is still high. A plethora of new drugs is entering clinical development for NHL treatment; however, the approval of new treatments remains low due in part to the paucity of clinically relevant models for validation. Canine lymphoma (cNHL) shares remarkable similarities with its human counterpart, making the dog an excellent animal model to explore novel therapeutic options. Therefore, driven by the great success achieved by immunotherapies in human NHL, comparative research has focused on the development of similar immunotherapeutic approaches for dogs. However, the successful use of this animal model remains challenging, still lacking the characterization of the canine immune system, of common tumor epitopes, the development of canine-specific/cross-reactive agents and the establishment of preclinical models. Within this context, we aimed to develop novel antibody-based therapies for cNHL, while contributing for the characterization and validation of the cNHL model for translational immune-oncology research. For that purpose, a cNHL biobank was successfully constructed. The clinical cytokine patterns in patients with cNHL were investigated, confirming a local and systemic dysregulation in cytokine response. Furthermore, a positive correlation between intratumoral immune response and a favorable response to chemotherapy indicates that the modulation of the immune response might contribute to improve patient outcomes. With that in mind, a through characterization of canine CD20 expression was conducted and contributed for the validation of this receptor as a potential immunotherapeutic target for cNHL. This motivated the development and identification of a panel of single domain antibodies (sdAbs) with high binding activity and specificity to canine and human CD20. In addition, to develop a novel drug delivery system for cNHL treatment, we described novel methodologies to identify potential targets, while selecting highly specific sdAbs against NHL. This work allowed to select a promising pool of sdAbs that specifically target NHL tumor receptors for the development of a novel antibody drug conjugate (ADC). Furthermore, we conducted a thorough investigation of a novel ADC payload – panobinostat - a potent histone deacetylase (HDAC) inhibitor with strong in vitro and in vivo antitumor properties in cNHL. Finally, we established a new bioluminescent murine model for monitoring tumor progression and treatment response in preclinical studies. In summary, the work presented herein allowed the establishment of a solid platform for the acceleration of the translational research of novel immunotherapeutic approaches for comparative oncology.RESUMO - Caracterização clínica e imunológica do linfoma canino como modelo animal : desenvolvimento de anticorpos recombinantes para tratamento e diagnóstico - O linfoma não-Hodgkin (LNH) é uma das principais causas de morte por neoplasia em todo o mundo, representando 90% de todos os linfomas. O LNH abrange um grupo heterogéneo de tumores, caracterizado pela proliferação de linfócitos malignos, 85-90% dos quais de linfócitos B. Os anticorpos direccionados para o recetor CD20, combinados com quimioterapias convencionais revolucionaram o tratamento do linfoma de células B, melhorando o tempo de remissão e aumentando a taxa de sobrevivência. No entanto, independentemente da terapêutica utilizada, a taxa de mortalidade mantém-se elevada. Uma grande diversidade de novos fármacos encontra-se em fase de desenvolvimento clínico para o tratamento do LNH; no entanto, a aprovação de novos tratamentos permanece baixa devido, em parte, à escassez de modelos clinicamente relevantes para validação. O cLNH e o LNH humano (hLNH) partilham muitas características histopatológicas, moleculares, genéticas e clínicas, desta forma o cão é considerado um excelente modelo animal para explorar novas opções terapêuticas. Consequentemente, a investigação em oncologia comparativa, motivada pelo grande sucesso alcançado pelas imunoterapias no tratamento do hLNH, tem-se focado no desenvolvimento de abordagens imunoterapêuticas semelhantes para cães. Contudo, o sucesso do cLNH como modelo animal tem vindo a revelar-se desafiante, na medida que a validação do seu uso para o desenvolvimento de imunoterapias ainda carece da caracterização do sistema imune canino, das células imunitárias e das moléculas efectoras, da avaliação dos epítopos tumorais comuns, do desenvolvimento de agentes imunoterapêuticos específicos para a espécie canina com potencial reacção cruzada com a espécie humana e do estabelecimento de modelos pré-clínicos para oncologia veterinária. Neste contexto, o presente trabalho teve como principal objectivo validar o cLNH como modelo animal para o desenvolvimento de novas estratégias imunoterapêuticas para LNH, visando estabelecer uma linha de investigação inovadora para o desenvolvimento de anticorpos recombinantes para o tratamento do cLNH. Neste sentido, desenvolveu-se uma estratégia multidisciplinar constituída por etapas complementares de modo a construir uma sólida plataforma para o desenvolvimento de ensaios clínicos de imunoterapias em oncologia comparativa...N/