The fruits as well as other organs of plants in its constitution have various
phytochemicals, including polyphenols, the antioxidant molecules highly abundant in
foods. Despite its ubiquity, its benefits to human health only start to be evaluated in
90’s, and it continues to reveal a growing interest, mainly due to epidemiological
studies suggesting a link between the consumption of food and beverages rich in
polyphenols and the reducing of the incidence and/or initiation of chronic and
degenerative diseases such as cardiovascular disease, atherosclerosis, and some cancers.
The investigation of its neuroprotective effects have being developed in the past 10
years, and it have been clearly demonstrated their ability to protect the cells either in
neuronal models in vitro and their in vivo intracellular effects.
A review of the evidences will be presented and in particular the work being
conducted in the laboratory of Disease and Stress Biology on the antioxidant power of berries such as wild blackberries, raspberry and strawberry tree fruit as well as their
leave

Ferreira, Ricardo Boavida

Oliveira, Pedro

Pontes, Vera

Santos, Cláudia N.

Tavares, Lucélia

Portuguese

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III Colóquio Nacional da Produção Pequenos Frutos Sever do Vouga, 26 e 27 Junho 2008  Actas Portuguesas de Horticultura nº 18 (2011)  97  Poder antioxidante dos pequenos frutos e seus efeitos benéficos para a saúde humana  Cláudia N. Santos1, Lucélia Tavares1, Vera Pontes1, Pedro Oliveira3 & Ricardo B. Ferreira1,4  1Disease and Stress Biology Laboratory – Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Av. da República, 2780-157 Oeiras, Portugal. csantos@itqb.unl.pt2Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Apartado 12, 2781-901 Oeiras, Portugal 3Unidade de Sistemas Agrários, Instituto Nacional de Recursos Biológicos, Oeiras, Portugal 4Departamento de Botânica e Engenharia Biológica – Instituto Superior de Agronomia, Universidade Técnica de Lisboa, Tapada da Ajuda, 1349-017 Lisboa, Portugal ResumoOs frutos assim como outros órgãos das plantas têm na sua constituição diversos fitoquimicos, entre os quais os polifenóis, das moléculas antioxidantes mais abundantes dos alimentos. Apesar da sua ubiquidade, os seus beneficios para a saúde humana apenas começaram a ser avaliados por volta dos anos 90, e continua-se a revelar um interesse crescente, principalmente devido aos estudos epidemiológicos que sugerem a existência de uma ligação entre o consumo de alimentos e bebidas ricas em polifenóis e a redução da incidência e/ou iniciação de doenças crónicas e degenerativas, tais como as doenças cardiovasculares, ateroscleroses e alguns cancros. A investigação dos seus efeitos neuroprotectores também tem sido muito desenvolvida nos ultimos 10 anos, em que se tem demonstrado claramente a sua capacidade de proteger as células neuronais em modelos in vitro e os seus efeitos intracelulares in vivo.  Será apresentada uma revisão destas evidências e em particular serão apresentados os trabalhos a decorrer no laboratório da Biologia da Doença e do Stresse sobre o poder antioxidante de pequenos frutos como as amoras silvestres, framboesa e medronho, tal como das respectivas folhas.  Palavras-chave: Rubus sp; Arbustus unedo; antioxidante intracelular; neurodegeneração. Abstract  Antioxidant power of small fruits and its beneficial effects to human health The fruits as well as other organs of plants in its constitution have various phytochemicals, including polyphenols, the antioxidant molecules highly abundant in foods. Despite its ubiquity, its benefits to human health only start to be evaluated in 90’s, and it continues to reveal a growing interest, mainly due to epidemiological studies suggesting a link between the consumption of food and beverages rich in polyphenols and the reducing of the incidence and/or initiation of chronic and degenerative diseases such as cardiovascular disease, atherosclerosis, and some cancers. The investigation of its neuroprotective effects have being developed in the past 10 years, and it have been clearly demonstrated their ability to protect the cells either in neuronal models in vitro and their in vivo intracellular effects. A review of the evidences will be presented and in particular the work being conducted in the laboratory of Disease and Stress Biology on the antioxidant power of III Colóquio Nacional da Produção Pequenos Frutos Sever do Vouga, 26 e 27 Junho 2008  Actas Portuguesas de Horticultura nº 18 (2011)  98  berries such as wild blackberries, raspberry and strawberry tree fruit as well as their leaves. Keywords: Rubus sp; Arbustus unedo; intracellular antioxidant; neurodegeneration. IntroduçãoHoje em dia é frequente surgirem apelos nos meios de comunicação social e na publicidade para o consumo de alimentos ricos em antioxidantes. Tal facto deve-se aos efeitos benéficos que os compostos antioxidantes têm para a saúde humana.  No organismo, em condições normais, ocorrem reacções que originam radicais livres de oxigénio, espécies muito reactivas que causam stresse oxidativo nas células. Esta situação provoca muitos danos ao nível das várias biomoléculas existentes dentro das células e essencias à vida. Normalmente este efeito é compensado pela acção de agentes e sistemas antioxidantes produzidos pelo própio organismo e que impedem a reactividade dos radicais livres. É mantida, assim a homeostase redox no organismo. Perante uma situação de doença, este equilibrio é frequentemente destabilizado, podendo o consumo de antioxidantes na dieta contribuir para o restabelecer do equilíbrio. Encontram-se entre os alimentos mais ricos em antioxidantes os frutos, vegetais, vinho tinto, chá, café, chocolate e as ervas aromáticas. Os efeitos benéficos para a saúde humana do consumo de antioxidantes pensa-se, presentemente, que está para além da sua actividade antioxidante. Fala-se hoje de compostos com efeitos nutracêuticos e cujos benefícios são descritos em várias patologias: doenças cardiovasculares (relaciona-se o consumo de vinho tinto com uma baixa incidência de problemas cardiovasculares); ateroscleroses; certos tipos de cancro; obesidade; envelhicemento (associa-se a longevidade dos chineses ao consumo de chá); doenças neurodegenerativas, em que estudos epidemiológicos indiciam que o consumo de antioxidantes na dieta pode influenciar a incidência de doenças como Alzheimer e Parkinson. Os pequenos frutos são dos principais alimentos com actividade antioxidante já relacionada com efeitos benéficos nas patologias descritas. Estão presentemente a decorrer no laboratório da Biologia da Doença e do Stress estudos sobre o poder antioxidante de pequenos frutos como a framboesa, amoras silvestres e medronho e também das respectivas folhas. Numa primeira fase é feita a pesquisa de extractos que exibam bioactividade por métodos químicos/bioquímicos: fenóis totais; flavonóides; capacidade antioxidante (para os radicais hidroxilo e para os radicais peroxilo); perfil de HPLC; e a capacidade inibitória de metaloproteases. Os extractos com bioactividade são sujeitos a uma confirmação dos seus efeitos bioactivos (neuroprotector, anticancerígeno) em linhas celulares humanas. Irão apenas ser apresentados os estudos que incidem na capacidade antioxidante dos extractos das plantas e avaliado o seu efeito neuroprotector.  Material e métodos Material vegetal: Frutos e folhas de Rubus idaeus, Rubus vigoi, Rubus sampaioanus, Rubus brigantinus, Rubus genevieri e Arbustus unedo foram colhidos e mantidos a -80 ºC até serem analisados. Extracção dos fenóis: Os frutos e as folhas foram macerados a um pó fino e foi feita uma extracção hidroetanólica na proporção 6 mL. g-1 peso fresco. A mistura foi agitada durante 30 min à temperatura ambiente, centrifugada a 12400 g durante 10 min e o sobrenadante filtrado com uma membrana de acetato de celulose de 0.20 µm e guardado a -80 ºC. III Colóquio Nacional da Produção Pequenos Frutos Sever do Vouga, 26 e 27 Junho 2008  Actas Portuguesas de Horticultura nº 18 (2011)  99  Determinação dos fenóis totais: A determinação dos fenóis totais foi realizada pelo método Folin-Ciocalteau [1]. O ácido gálico (GA) foi utilizado como padrão e os resultados expressos como mg GAE. g-1 peso seco (GAE-“gallic acid equivalent”). Capacidade antioxidante in vitro: A capacidade de captar radicais peroxilo foi determinada pelo método ORAC (do inglês “Oxygen Radical Absorbance Capacity”) [3, 4]. Os resultados foram expressos como mmol TE. 100 g-1 peso seco (TE-“trolox equivalent”), sendo utilizado o Trolox como padrão. Capacidade antioxidante intracelular: Células de neuroblastomas foram pré-incubadas durante 1 hora com os extractos das plantas e depois foram incubadas com H2O2 (1 mM) durante 1 hora. A viabilidade celular foi posteriormente avaliada com o kit CellTiter-Blue®. O efeito antioxidante foi analisado pelo incremento na % de viabilidade celular, em que no controlo do stresse oxidativo com 1 mM H2O2 durante 1 hora obteve-se apenas 25 % de células viáveis. Resultados e discussão Monitorizou-se o conteúdo em fenóis totais e actividade antioxidante para os frutos e folhas de Rubus endémicos do Norte de Portugal colhidos nas zonas indicadas na Figura 1 e sempre comparados com a uma espécie de Rubus cultivada (Rubus idaeus), a framboesa, oriunda da Herdade Experimental da Fataca, Odemira. Como se pode constatar na Figura 2 os frutos dos Rubus endémicos, com excepção do R. genevieri, são comparativamente a uma espécie de Rubus cultivada (Rubus idaeus) mais ricos em compostos fenólicos, o que se reflecte numa maior capacidade antioxidante para captar os radicais peroxilo. O R. genevieri apresenta um conteúdo em fenóis totais consideravelmente mais elevado que o detectado na framboesa o que não se reflecte numa maior capacidade antioxidante para captar os radicais peroxilo. Poderá ser interessante a avaliação deste extracto para a capacidade de captar outras espécies reactivas com importância biológica como o radical hidroxilo. O medronho (Arbutus unedo) foi igualmente avaliado para a bioactividade de antioxidante. Este fruto, colhido na Serra da Arrábida, é característico das regiões mediterrâneas embora não esteja introduzido directamente na dieta alimentar. A avaliação química dos fenóis totais e da actividade antioxidante foi realizada para os frutos e folhas. No que respeita aos frutos e comparativamente à framboesa, o medronho tem níveis totais em fenóis e uma actividade antioxidante equivalente (Figura 2).  No que respeita à avaliação das folhas de género Rubus (Figura 3), curiosamente, os níveis de fenóis totais são aproximados entre as várias espécies, mas existe uma grande variação na actividade antioxidante detectada e significativamente superior à da folha de framboesa. Os resultados indiciam que os frutos de Rubus endémicos de Portugal são muito ricos em antioxidantes e as folhas das mesmas espécies apresentam níveis ainda mais elevados de capacidade antioxidante. Torna-se no entanto necessário confirmar o potencial genético destas plantas como fontes ricas de antioxidantes submetendo as plantas às mesmas condições edafoclimáticas. Para o efeito já se iniciou a sua adaptação em estufa (Figura 4) e já se encontram presentemente num campo experimental e aguarda-se a produção de futos para nova avaliação dos parâmetros O medronho não apresentou nos testes efectuados uma capacidade antioxidante notória, mas em contrapartida as suas folhas revelaram-se uma fonte promissora de um extracto natural enriquecido em fitoquímicos antioxidantes (Figura 3). Após os testes de avaliação da capacidade antioxidante in vitro, procedeu-se à avaliação da capacidade antioxidante intracelular numa linha celular de neurónios III Colóquio Nacional da Produção Pequenos Frutos Sever do Vouga, 26 e 27 Junho 2008  Actas Portuguesas de Horticultura nº 18 (2011)  100  humanos, os neuroblastomas SK-N-MC. Optou-se por uma linha de neuroblastomas já que nas doenças neurodegenerativas, um dos factores preponderantes é o aumento da produção de espécies reactivas intracelulares. A capacidade antioxidante intracelular foi avaliada pelo aumento percentual da sobrevivência das células perante um stresse oxidativo quando pré-incubadas com os extractos com os fitoquímicos das plantas comparativamente a quando não incubadas (vide métodos). As concentrações em fenóis que foram testadas neste teste foram previamente definidas por testes de citotoxidade obtidos pela incubação com concentrações crescentes em fenóis e para os quais a viabilidade celular é avaliada pelo kit CellTiter-Blue®. Os testes à capacidade antioxidante intracelular foram apenas realizados nesta fase para a framboesa e medronho e para as folhas de medronheiro. Na figura 5 pode-se constatar que a actividade antioxidante detectada in vitro para a framboesa confirma-se no modelo celular, já que uma pré-incubação destes extractos consegue aumentar significativamente a percentagem de sobrevivência dos neuroblastoma perante um stresse oxidativo. Relativamente ao medronho, o extracto deste fruto não revelou qualquer eficácia perante este teste ou seja não alterou a taxa de sobrevivência das células (dados não mostrados). Por outro lado a folha de medronheiro (Figura 6) apresentou uma actividade neuroprotectora muito significativa, verificou-se que a pré-incubação com 30 g de GAE.ml-1 consegue aumentar cerca de em 86% a viabilidade celular das células após um stresse oxidativo. Estes resultados preliminares são bons indicadores do potencial que os extractos estudados têm como fontes em compostos fitoquímicos antioxidantes naturais. A actividade antioxidante intracelular deverá ser confirmada por citometria de fluxo. Este e outros estudos serão realizados para confirmar o potencial destes compostos como ingredientes activos na formulação de suplementos alimentares, cosméticos ou em produtos farmacêuticos.  Agradecimentos Pela recolha do material na Serra da Nogueira e Parque natural de Montesinho o Eng. Carlos Aguiar do Centro de Investigação da Montanha, Instituto Politécnico de Bragança. Pela identificação botânica e arquivo de espécime em herbário à Doutora Dalila Espírito Santo do Jardim Botânico da Ajuda do Instituo Superior de Agronomia. À FCT pelo apoio financeiro dado a C. Santos (SRFH/BPD/26562/2006) e L. Tavares (SFRH/BD/37382/2007). Referências Cao G, Alessio HM & Cutler RG. (1993) Oxygen radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radic Biol Med. 14:303-311. Michalska, A. Ceglinska, A. Zielinski, H. (2007) Bioactive compounds in rye flours with different extraction rates. Eur Food Res Technol 225:545-551. Singleton V. L. & Rossi JA. (1965) Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 16:144-158. Wang SY & LinHS. (2000) Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry, raspberry and strawberry varies with cultivar and developmental stage. J Agric Food Chem. 48:140-146. III Colóquio Nacional da Produção Pequenos Frutos Sever do Vouga, 26 e 27 Junho 2008  Actas Portuguesas de Horticultura nº 18 (2011)  101  R. sampaioanusR. brigantinusR. vigoiMontanha da NogueiraR. henriquesiiParque Natural do MontesinhoR. genevieriR. idaeusR. idaeusArbutus unedoSerra da ArrábidaHerdade Experimental da FatacaQuadros e figuras                       Figura 1 – Localização aproximada e fotos no local de colheita das espécies de Rubus endémicas indicadas, Rubus ideaus e de Arbutus unedo.    Figura  2 – Conteúdo em fenóis totais e capacidade antioxidante in vitro dos extractos de frutos das espécies indicadas. Valores obtidos do doseamento dos fenóis totais (mg GAE g-1 ps      ), e do método ORAC (mmol TE 100 g-1 ps     ) (vide métodos). 05101520253035404550ArbutusunedoRubus idaeus RubusbrigantinusRubusgenevieriRubussampaioanusRubus vigoiIII Colóquio Nacional da Produção Pequenos Frutos Sever do Vouga, 26 e 27 Junho 2008  Actas Portuguesas de Horticultura nº 18 (2011)  102   Figura 3 – Conteúdo em fenóis totais e capacidade antioxidante in vitro dos extractos de folhas das espécies indicadas. Valores obtidos do doseamento dos fenóis totais (mg GAE g-1 ps      ) e do método ORAC (mmol TE 100 g-1 ps    ) (vide métodos). 0100200300400500600700800900Arbutus unedo Rubus idaeus Rubusbrigantinus Rubus genevieri Rubussampaioanus Rubus vigoi III Colóquio Nacional da Produção Pequenos Frutos Sever do Vouga, 26 e 27 Junho 2008  Actas Portuguesas de Horticultura nº 18 (2011)  103    Figura 4 - Aclimatização em estufa dos Rubus endémicos da zona envolvente da área de Bragança  III Colóquio Nacional da Produção Pequenos Frutos Sever do Vouga, 26 e 27 Junho 2008  Actas Portuguesas de Horticultura nº 18 (2011)  104   Figura 5 - Incremento da % de viabilidade celular do neuroblastoma SK-N-MC perante um stresse oxidativo induzido após a pré-incubação com extractos de framboesa (Rubus idaeus) (vide métodos ).    Figura 6 - Incremento da % de viabilidade celular do neuroblastoma SK-N-MC perante um stresse oxidativo induzido após a pré-incubação dos extractos de folhas de medronheiro (Arbustus unedo) (vide métodos).       010203040506070809010050 125 175% Incremento da viabilidade celular01020304050607080901007,5 15 30% Incremento da viabilidade celular g GAE. mL-1

Antioxidant power of small fruits and its beneficial effects to human health

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