Universidade Técnica de Lisboa. Faculdade de Medicina Veterinária
Abstract
Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaConsidering that the acid tolerance is an important virulence factor of foodborne pathogens
and the expressive increasing of incidence of Campylobacter jejuni in recent years as
etiologic agent of human campylobacteriosis, this work aimed to evaluate the ability of C.
jejuni to survive under acid stress. Strains of different origins (reference, turkey isolates) and
tolerance to particular stresses (acid and temperature) were tested for survival in liquid
defined media with pH values of 5.0 and 7.0 adjusted with 1M HCl. Experimental conditions
were performed at 2 different temperatures: 4 ºC and 37 ºC. C. jejuni cells were found to be
very sensitive to acid stress at 37 ºC, whereas they were more resistant at 4 ºC. A strain effect
was observed at 37 ºC. Temperature of 37 ºC combined with acid stress allowed a rapid
decrease in the C. jejuni population, whereas low temperature (4ºC) considerably decreased
the effect of acid stress. The survival curves were either described by the Weibull or
traditional first-order model and goodness of fit of these models was investigated. Regression
coefficients (R2), root mean square error (RMSE) and correlation plots suggestted that
Weibull model produced a better fit to the data than the traditional model.
Fluorescence Ratio Imaging Microscopy (FRIM) was used to determine intracellular pH (pHi)
as an indicator of the physiological state of C. jejuni cells at the single cell level after
treatment with hydrochloride acid (1M HCl, pH 4.0) in liquid defined medium. For all the
tested strains pHi of healthy cells was found to be above 7.0. After exposure to HCl in liquid
medium an immediate decline in pHi to 5.5 (detection limit) was observed in the majority of
cells (75%) of one strain within 15 minutes. The FRIM results revealed that the
subpopulations with pHi>5.5 increased for this strain, especially subpopulations with
5.5<pHi<6.0 and 6.0<pHi<6.5 following 200 min. of exposure to HCl. This indicates that
some strains of C. jejuni may employ certain recovery strategies to extrude protons and to
increase pHi.RESUMO -
Considerando que a tolerância ao ácido é um importante factor de virulência de agentes
patogénicos veiculados por alimentos, condicionando a sobrevivência dos microrganismos, e
o expressivo aumento, nos últimos anos, da incidência de Campylobacter jejuni como agente
etiológico de campilobacteriose humana, este trabalho teve como objectivo avaliar a
capacidade do patogénico C. jejuni sobreviver em condições de stresse ácido. Estirpes de
diferentes origens (referência, isolados de peru) sujeitas a diferentes factores de stresse
(acidez e temperatura) foram testadas avaliando-se a sua sobrevivência em meio líquido (pH
5.0 e 7.0). As condições experimentais foram efectuadas a duas temperaturas diferentes: 4 ºC
e 37 ºC. Células de C. jejuni mostraram-se muitos sensíveis a stresse ácido a 37 ºC, enquanto
a 4 ºC foram mais resistentes. O efeito estirpe foi evidenciado a 37 ºC. A temperatura 37ºC
em combinação com um pH 5.0 (stresse ácido) causou rápido decréscimo da população de C.
jejuni, enquanto que a 4ºC o efeito do stresse ácido diminuiu consideravelmente. As curvas de
sobrevivência foram descritas pelos modelos Weibull ou pelo modelo clássico de inactivação
de primeira ordem, tendo-se concluído através dos coeficientes de regressão (R2), raízes
quadradas do erro médio (RMSE) e gráficos de correlação que o modelo Weibull se adequa
melhor aos dados apresentados que o modelo tradicionalmente utilizado.
O racio da emissão de fluorescência medida pela técnica de microscopia óptica invertida foi
utilizado para determinar o pH intracelular (pHi) como indicador do estado fisiológico das
células de C. jejuni, a um nível celular único, após aplicação de um tratamento com ácido
clorídrico (1M HCl, pH 4.0) em meio de cultura líquido. Para todas as estirpes testadas, o pHi
de células saudáveis encontrava-se acima de 7.0. Após exposição a HCl em meio líquido, foi
detectado para uma das estirpes, um decréscimo imediato do pHi para 5.5 (limite de detecção)
na maioria das células observadas (75%) ao fim de 15 minutos. Os resultados da medição de
fluorescência revelaram um aumento de subpopulações com pHi>5.5 para essa estirpe,
nomeadamente subpopulações com 5.5<pHi<6.0 e 6.0<pHi<6.5 em 200 min. de exposição a
HCl. Estes resultados indicam que algumas estirpes de C. jejuni poderão utilizar determinadas
estratégias de recuperação para exteriorizar protões e elevar o pHi
