富山大学・富理工博甲第113号・矢口甫・2016/09/28・★論文非公開★富山大学201

矢口 甫

富山大学博士（理学）Article富山大学・富理工博甲第113号・矢口甫・2016/09/28・★論文非公開★2016thesi

矢口, 甫

University of Toyama Repository

1           SUMMARY (JAPANESE)   2    学位論文題目 ネバダオオシロアリ（シロアリ目：オオシロアリ科）の兵隊分化の至近機構に関する生態発生学的研究）  地球生命環境科学専攻 氏名 矢口 甫  生物の表現型は，遺伝的要因により一義的に決定されるわけでなく，環境要因によっても強く影響を受ける。表現型の発現が環境要因によって柔軟に変化する現象（表現型可塑性）のうち，明瞭に異なる表現型を発現させる場合を表現型多型とよぶ。表現型多型の代表例として，社会性昆虫の巣内の形態多型（カースト）が挙げられる。カースト分化は，温度や湿度などの外部刺激に加えて，個体間の相互作用により伝達される社会シグナルが環境要因として作用することで調節される。個体間コミュニケーションにより特徴づけられる社会性の出現は，多細胞生物の出現と並び，生物進化における主要な変遷の一つである。カーストの出現や利他性の進化は自然選択説で説明することが難しく，ダーウィンのジレンマとして広く認識されている。 シロアリ類の兵隊は，攻撃に特化した武器形態を有し，顕著な防衛行動を示す点で，社会性昆虫が持つカーストの中で最も特殊な存在である。現生のシロアリ類のほぼすべての種が兵隊を保有しており，シロアリ類の共通祖先で獲得された単一起源の形質であると考えられている。兵隊分化は，幼若ホルモン（JH）量の上昇に応じた２回の脱皮が必ず必要とされる。しかしながら，兵隊の分化機構，特に JH 量の上昇をもたらす上流の発生機構は全く不明である。この最大の理由は，自然条件下で兵隊に分化する個体を予め特定できないためである。しかし近年，ネバダオオシロアリ Zootermopsis nevadensisの初期巣において，兵隊に分化する個体を予め特定できることが報告された。すなわち，初期巣内で最初に 3齢に脱皮した幼虫（No. 1）は，生殖虫からの栄養交換を高頻度に受け，前兵隊（兵隊への分化過程の中間段階の個体）に必ず分化する。一方で，巣内で 2番目に 33  齢に脱皮した幼虫（No. 2）は，他個体への世話行動を頻繁に行い，前兵隊には分化せず 4齢に脱皮する。本種は，シロアリ類で初めてゲノムが解読された種である。したがって，兵隊における未知の分化機構を明らかにする上で，分化前から個体発生を詳細に比較できる本種の初期巣の個体は，最適なモデルになると考えられる。そこで本博士論文では，本種の初期巣の No. 1および No. 2に注目し，兵隊分化の至近機構の解明を目指した。 多くの昆虫では，JH生合成遺伝子の発現レベルが JH量と相関することが報告されている。したがって，JH合成遺伝子の発現パターンに注目することで，JH量の上昇時期を予測できると考えられる。そこで，昆虫で広く保存された JH合成経路に注目し，No. 1と No. 2の脱皮後 0-1日目，2-3日目，4-5 日目の個体を用いて，各遺伝子の発現解析を行った。その結果，解析した 13 遺伝子のうち，JH合成経路の最終ステップに関与する JHAMT（脱皮後 2-3日目）と CYP15A1（脱皮後 4-5日目）が，No. 1の発生過程で特徴的に高発現することが明らかになった。これらの発現パターンに注目することで，JH量の上昇時期を推察できると考えられる（第 1章）。 一般的に動物では，行動改変を制御する因子としてドーパミン（DA）が重要であることが知られている。そこで次に，No. 1と No. 2の脱皮後 0および 3日目の脳内 DA量を，HPLCにより測定した。その結果，No. 1でのみ脳内 DA量が３日目に上昇した。この時期には，DA合成遺伝子の発現レベルも高いことが確認された。さらに，No. 1の脱皮後 1日目に DA受容体拮抗剤を処理したところ，生殖虫からの栄養交換頻度が低下し，前兵隊分化率が有意に減少した。したがって，脳内の DA 量の変化は，生殖虫との栄養交換行動を介して，前兵隊分化に影響することが示唆される（第 2章）。 シロアリ類の兵隊分化では，栄養交換行動や JH量の上昇に関係した未知の制御因子の存在も予想される。そこで，No. 1と No. 2の脱皮後 0および 3日目の個体を用いて，発現遺伝子を網羅的に解析した。RNA-seq解析の結果，No. 1の脱皮後 3日目で，特異的に発現上昇するリポカリン遺伝子 Neural Lazallilo（ZnNLaz）を特定した。他種のホモログとの分子系統解析を行ったところ，シロアリ類の NLazホモログは有意な正の選択を受けていることが判明した。RNA干渉（RNAi）による機能解析を行った結果，女王から受ける栄養交換頻度が著しく低下し，前兵隊分化率が有意に減4  少した。ウェスタンブロットおよび免疫組織染色法による局在解析の結果，No. 1の腸上皮細胞で特異的なシグナルが検出された。したがって，ZnNLazは，女王との栄養交換頻度を調節して何らかのシグナルを受容する因子として働き，前兵隊分化を制御する可能性がある（第 3章）。  最後に，No. 1における DAシグナルの活性化と ZnNLazの発現上昇との関係を解析した。まず，生殖虫との個体間コミュニケーションを変化させた場合に生じる影響を調べた。その結果，王のみ存在する条件下では，No. 1からの前兵隊分化率が有意に低下した。No. 1の ZnNLaz発現は，女王または王のみ存在する条件下では，両者とも存在する条件下よりも有意に低かった。しかし，No. 1の脳内 DA量には違いが見られなかった。次に，ZnNLazの RNAi処理後の No. 1を用いて，脳内 DA量を測定したところ，コントロールとの有意な違いは検出されなかった。一方で，DA受容体拮抗剤で処理した No. 1の ZnNLaz発現は，コントロールと比較して有意に変動した。以上の結果は，脳内の DAシグナルの活性化は，ZnNLazの発現に影響を与え，女王との個体間コミュニケーションを介して前兵隊分化を引き起こす可能性を示す（第 4章）。 本博士論文では，ゲノム情報を利用できるネバダオオシロアリの初期巣の兵隊分化に注目し，未知の至近機構の解明を目指した。その結果，これまで解析する手立てすらなかった JH量上昇前の時期における，兵隊分化の初期要因を明らかにすることができた。特定した重要因子は，生殖虫との栄養交換行動と関係することが示されたが，何れの因子も他の昆虫で広く保存されている。シロアリ類がゴキブリ様の祖先群から進化した過程で，各因子が親子間の個体間相互作用を制御する新たな機能を獲得した可能性も考えられる。今後，カースト分化機構を包括的に理解するためには，各因子の他のカースト分化調節における役割（特に JHやホルモンとの関係）や，他のシロアリや近縁群（特にシロアリの姉妹群であるキゴキブリ）における機能を調べる必要がある。 

Ecological developmental studies on the proximate mechanisms of soldier-caste differentiation in the damp-wood termite Zootermopsis nevadensis (Isoptera: Archotermopsidae)

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ネバダオオシロアリ（シロアリ目：オオシロアリ科）の兵隊分化の至近機構に関する生態発生学的研究

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