小島 隆

University of Toyama Repository

富 山 医薬大医誌 1 巻 1 号 1987年B 型肝炎 ウ イルス関連抗原およ び δ抗原の肝細胞内局在 と 病態 に つ い て一一 免疫電顕 に よ る検討一一富 山 医科薬科大学 内 科学 第 3 教室小 島 隆Blumberg に よ る オー ス ト ラ リ ア 抗 原 の 発 見 （ Blu­mberg, B. S. et al. 1965 ） を 契機 に ， B 型 肝 炎 ウ イ ルス （ H BV ） に つ い て の知 見 は ， 臨床面お よ び本態解明 と い う 面 よ り 飛躍 的 な 発展 を と げ て き た 。 現在では HBV に 関 し て 免疫 学 的 に 3 つ の 異 っ た 抗 原 の 存在が知 ら れて お り ， Blumberg が最初 に 血清 中 に 見出 し た オ ー ス ト ラ リ ア 抗 原 は ， リ ポ蛋 白 よ り な る 直径22nm の 小 型球状粒子， 管状粒子お よ び、直径42nmの大型の Dane 粒子 の表面 （ surface ） に み ら れ る 抗原 で あ り ， H Bs 抗原 と よ ばれ て い る 。 一方， Dane粒子は そ の 内 に 二重鎖環状 DNA, DNA dependent DNA polymerase が確認 さ れ て お り ， H BV そ の もの と 考 え ら れて い る 。 こ の 二重構造 を も っ Dane 粒子 の 内 部 の核様構造 （ core ） に は ， H Bs 抗 原 と は 別の抗原性が認め ら れて お り ， HBc 抗原 と よ は、れて いる 。 第 三 の 抗 原 は 1972年 Magnius と Espmark によ り 発 見 さ れ た H Be 抗 原 （ Magnius, L. 0. and Espmark, J. A. 1972 ） で， 臨 床 面 か ら の解析に よ りHBV の感染性 と 密 接 な 関 連 の あ る こ と が判 明 し ，さ ら に近年 こ の HBe 抗 原 は H Bc 抗 原 と 同 ー の po-lypeptide 上 に 存 在 し ， core 粒 子 形 成 に 際 し H Bc抗原 を 外側 に H Be 抗原 を 内 側 に 包 み 込む よ う に して 存 在 す る こ と が 明 ら か に さ れ た （ Takahashi, K.  et al ,  1981 ） 。 本 稿 で は ， こ れ ら H BV 関連抗 原 の 肝細胞 内 での 局 在 を 酵素抗体法 を 用 い光顕お よ び電顕レ ベ ル で検討 し ， H BV の 肝 細 胞 内 での増殖動態 につ い て 考察 し ， さ ら に こ れ ら 抗 原 を 標 的抗原 と す る免疫機序 を 介 し て の 肝 細 胞 障害機構 に つ い て 述べ る 。Rizzetto ら に よ り 発見 さ れ た hepatitis delta （δ） virus(HDV) ( Rizzetto, M. et al . 1977 ） は ， そ の 感染増殖に H BV の helper function を 必要 と す る 特殊な defective virus で あ る こ と が明 ら か に さ れて い る 。こ の HDV に よ る S 肝 炎 は 日 本 で は 稀れ で あ る が，近年 HDV と 非 A 非 B 型 （ NA N B ） 肝 炎 ウ イ ル ス との 類似性が問題に さ れ て き て い る 。 本稿 の 後半 で は ，こ の S 肝 炎 の研究が NANB 肝 炎 解 明 へ の 糸 口 と なり 得 る か検討す る 。1 .  B型肝炎 と B型肝炎 ウ イ ル スB 型 肝 炎生検肝組織 を 通常電顕に て 観察す る と 、直 径 約 27nm の core 粒 子 が 肝 細 胞 核 内 お よ び細 胞質 内 の cytoplasmic matrix に 観察 き れる 。 。 一方，小 胞体腔 内 に は 直径約42nm の二重構造 を も っ Dane粒子が観察 さ れ （ Fig. 1 ・A ） ， そ の一 部は 小 胞体 膜 と直 接 連 続 し て い る こ と よ り ， Dane 粒子 は core 粒子 が 小 胞 体 の 膜 を 被 っ て 小胞体腔 内へ budding する こ と に よ り 形成 き れ る も の と 推 定 き れ て い る 。 なお ， 小胞体腔 内 に は 多数の管状構造 物 も 観察 き れ るが ， こ れ は 過剰 に 産 生 さ れ た H Bs 抗原 と 考 え ら れて い る 。こ の よ う な HBV 関 連 粒子に 加 え て ， 粒子形態 をと ら な い HBV 関 連抗原の検討 を 主 た る 目 的 に 酵素抗体法に よ る 光顕お よ び電顕 レ ベルでの検 索 を 試みた 。 H Bs 抗 原 は 肝 細 胞 膜 を 含 む 細 胞質 内 に 観察 され， 免 疫 電 顕 に よ る 検討 で は H Bs 抗 原 は 小 胞体膜，小 胞体腔 内 の管状構造物， Dane 粒子 の 外被 ま た 時弓t円ru小 島 ｜塗に は 肝 細 胞膜 に 認め た （Fig. 1・B ） 。 H Bs 抗 原 は 肝細 胞核 内 お よ び 細 胞質 内 に 観察 さ れ た が， 一般 に 肝小 葉 内 の 炎症性変化 に 乏 し い症例 では核内 に 限局 して 観察 さ れ， 一方， 炎症性変化 の 強 い 例 では 主 と して 肝 細 胞 質 内 に 認め た 。 H Be 抗 原 の 局 在 は ， H Bc抗 原 の そ れ と ほ ぼ類似 の パ タ ー ン を 示 し 肝細 胞 内 の核 と 細 胞質 内 に 観察 さ れ た 。 HBc 抗 原 お よ び H Be抗 原 の 免疫 電 顕 に よ る subcellular level の 検 討 では ，両 抗 原 は cytoplasmic matrix お よ び ribosomes上 に 観察 さ れ た 。 特記すべ き こ と は ， 少数 の 肝 細 胞に お い て H Bc 抗 原 が細 胞膜上に 観察 さ れ た こ と であ り ， 免疫性肝障害に 際 し て の標 的抗 原 と し て 細 胞膜 上 に 表 出 し た H Bs 抗 原 だ け で な く H Bc 抗 原 もそ の可能性が考慮、 さ れ る べ き も の と 思わ れ る （ Kojima,T. and Desmet, V.  J .  1984 ） 。 こ れ ら の 所 見 よ り ，H Bc 抗 原 お よ び H Be 抗 原 活性 を 示す ポ リ ペ プ タ イド は 細胞質 内 の ribosomes 上 で合成 さ れ た 後， 核 内に migrate し core 粒子 に assemble さ れ た 後， 再び核 膜 孔 を 通 っ て 細 胞 質 内 に 出， H Bs 抗 原 活性 を 示す 小 胞 体 膜 あ る い は 細 胞 膜 を 被 っ て Dane 粒 子 を形 成 し て く る も の と 考 え ら れ る 。 な お ， ribosomes上で合成 さ れた H Bc 抗原 と HBe 抗 原 活性 を 示す ポリ ペプ タ イ ド の一部は core 粒子 に assemble さ れ るこ と な く ， 直接血 中 に 放 出 さ れ る こ と が考 え ら れ てい る （ Koj ima, T. 1982 ） 。こ の よ う な H BV 感染肝 細 胞 に 対 し て は ， リ ン パ球 を 主体 と す る 多 数 の 炎症細 胞 の 浸潤 が観察 さ れ るが， 単 ク ロ ー ン 性抗 ヒ ト ・ リ ン パ球抗体 に よ る 検討で は ， 浸潤 リ ン パ球の王体は cytotoxic T-cell で ある こ と が明 ら か に さ れ た （ Sasaki, H .  et al. 1984 ） 。2 . δ肝炎 と δ肝 炎 ウ イ ル ス- 28 ーRizzetto ら は ， B 型 肝 炎 の 免疫 組織学的研究の過程 で H BV 関連抗原 と は 明 ら か に 異 な る S 抗原， S 肝炎 を 発見 し た （ Rizzetto, M. et al. 1977 ） 。 こ の 発 見か ら 比 較 的 早 い 時 期 に S 抗 原 ・ 抗 体 系 の radioim­munoassay (RIA） 法が開発 き れ （ Rizzetto, M. et al. 1979 ） ， そ の 結 果 S 抗 体 陽 性 者 で は HBV 関 連抗 原抗体 も 同 時 に 陽性 を 示す こ と が判 明 し た 。 さ ら に δ肝 炎 発症早期 に は， 血 中 に δ 抗 原 の 出現が認め ら れ，こ の δ 抗 原 陽 性 血 清 中 か ら 直径35～37nm の S 感染粒子 が 同 定 き れ る に 至 っ た （ Rizzetto, M. et al .  1980 ） 。 こ の RIA 法 を 用 い た 検討 に よ り ， δ 肝 炎 はイ タ リ ア を 中 心 と し て 地 中 海沿岸諸 国 に 見 ら れ， 米国 での 成 績 は 移 民 イ タ リ ア 人 を 中 心 に 高頻 度 に 分布し ， ま た 最近 の 成 績 では ， ア フ リ カ ， 東 南ア ジ ア にも 広 く そ の分布が あ り ， さ ら に 南米ベネ ズ エ ラ ではイ ン デ ィ ア ン の 間 での 集 団 発生 が報告 さ れ て い る 。一方， チ ン パ ン ジ ー を 用 い た δ 肝 炎 感染実験 に お いて ， δ 肝 炎 チ ン パ ン ジ ー 肝 細 胞 に も 非特異 的構造物では あ る が， チ ン パ ン ジ － NANB 肝 炎の感染指標であ る 管状構造物が見 ら れ る こ と が 明 ら か に さ れ， S肝 炎 と NANB 肝 炎 と の 類似性が注 目 さ れた （ Kamimura, T. et al .  1983 ） 。こ の よ う な 背 景 の も と ， 筆者 ら は 免疫電顕法に より 肝 細胞 内 δ 抗 原 の 局 在 を 検討 し ， 形 態 学 的 に 確 認で き る δ 抗 原 に 特 異 的 な 粒子 の 検討 お よ び肝 細 胞 にお け る δ粒子形成 に 際 し こ の δ 抗 原 と S 粒子 内 RNAと の 関 連 に つ き 検討 し た （ Kojima, T. et al. 1986 ） 。肝組織内 S 抗 原 は ， 主 に 肝細胞核内 （ Fig. 2-A ） に観察 さ れ た ほ か， 時 に 細 胞 質 内 に も 認め た 。 肝 細 胞核 内 の s抗原は， 核 の chromatin 領域に 直径約20 ～30nm の 不 均ー な 頼 粒 状 の構造物の集積 と し て 観察さ れ た （ Fig, 2 -B ） 。 核小体 は 陰性 であ っ た 。 s 抗 原に 特 異 的 な 構造物の検討 で は ， NANB 肝 炎 チ ン パン ジ ー で最初 に 報告 さ れ た nuclear particles と 区別 不 可 能 な nuclear aggregates に δ 抗 原 が観察 され て お り （ Fig. 2 B ) , 8 肝 炎 お よ び NANB 肝 炎 におけ る こ れ ら nuclear particles が両疾患， と り わ け難解 の NANB 肝 炎 に お い て も 感染粒子 で あ る 可能性が推測 さ れ た （ Koj ima, T. et al. 1986 ） 。一方， δ 抗 原 の 細 胞 質 内 局 在 を 示 し た 肝細 胞 の 免疫 電 顕 に よ る 検 討 で は ， δ 抗 原 は 細 胞 質 内 の cyto­plasmic matrix に 観察 さ れた ほか， 一部 の 肝細 胞 でB 型 肝 炎 ウ イ ル ス 関連抗原お よ び S 抗 原 の 肝 細 胞内 局 在 と 病態 に つ い て 一 免疫電顕に よ る 検討は free お よ び membrane-bound ribosomes 上に 認め た （ Fig. 2・C ） 。 既に 述べ た 如 く ， 血 中 S 粒子は その内部に S抗 原 （ 168 , 000MW ） と 1750塩基 の RNAを 含 み ， 外 被 と し て H Bs 抗 原 に 包 ま れ て い る 。 この δ 粒子 内 RNA は single strand RN A で あ り ， その末端に は 3'-poly-(A) tail は な く ， negative strand virus と 考 え ら れ て い る 。 し た が っ て ， ribosomes上 に 観察 さ れ た S抗 原 は ， こ の single strand RN A が直接 ま た は 間接 的 に translate さ れ た も の と 推 測さ れ る 。本論文 の要 旨 は ， 第36 回 米 国 肝 臓学会 （ AASLD ) ,1985, 1 1 ,  Chicago, International Symposium : He patitis Delta Virus and Its Infection, 1986, 6, Aos­ta, Italy お よ び International Conference on the Impact of Viral Diseases on the Development of Asian Countries, 1986, 12 ,  Bangkok に て 発表 し た 。文 献1 ) Blumberg B. S., Alter H. J. and Visnich S. : A "new” antigen in leukemia sera. JAMA 191 : 541・546, 1965. 2 ) Kamimura T., Ponzetto A., Bonino F., Fem-n叫JW内4stone S. 恥1., Gerin J. L. and purcell R. H. : Cytoplasmic tubular structures in liver of H BsAg carrier chimpanzees infected with delta agent and comparison with cytoplasmic structures in non-A, non-B hepatitis. Hepato・logy 3 :  631 ・637, 1983. 3 ) Kojima T . .  Immune electron microscopic study of hepatitis B virus associated anti・gens in hepatocytes. Gastroenterol Jpn. 17 : 558・575, 1982. 4 ) Kojima T. and Desmet V. J. : Hepatitis B core antigen (HBcAg) in liver cell plasma membrane : Immunoelectron microscopic study. Liver 7 :  191 -200, 1987. 5 ) Kojima T. Callea F., Desmyter J. and Desmet V. J. : Immune electron microscopy of hepa­tit is δ－antigen in hepatocytes. Lab. Invest. 55 : 2 17-225, 1986. 6 )  Magnius L. 0. and Espmark J. A. : New specificities in Australia antigen positive sera dlstinct from the Le BOUVIER determ1-nants. J. Immunol. 109 : 1017-1021 ,  1972. 7 ) Rizzetto M. ,  Canese M. G. ,  Arico S. ,  Crivelli 0., Trepo C., Bonino F. and Verme G. : Im­munofluorescence detection of new antigen­antibody aystem (8/anti-8) associated to hepatitis B virus in liver and in serum of H BsAg carriers. Gut. 18 : 997-1003, 1977 8 ) Rizzetto M., Shih J. W-K, Gocke D., Purcell R. H. ,  Verme G. and Gerin J. L. : Incidence and significance of antibodies to delta anti­gen in hepatitis B virus infection. Lancet ii : 986-990, 1979. 9 ) Rizzetto M., Hoyer B. ,  Canese M. G., Shih J W-K. ,  Purcell R. H .  and Gerin J. L. · δ agent : Association of 8 antigen with hepatitis B surface antigen and RNA in serum of 8-m­fected chimpanzees. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 6124-6128, 1980. 10 )  Sasaki H., Koj ima T., Matsui S., Aoyama K., Higuchi K., Inoue K. : Interaction of lympho­cytes with hepatocytes bearing hepatitis B 小 島antigen : Ultrastructural investigation of tar­get antigen and T cell subsets dy means of peroxidase antibody technique. Hepatology 4 : 781, 1984. AU 丹、u隆写 真 説 明Fig. 1 肝 細 胞 小 胞体 内 に 観察 き れ る Dane 粒子 （ 1 -A ） 。 uranyl acetate and lead cit­rate. （ × 100000）。 H Bs 抗原陽性の小胞体 膜 と Dane 粒子 （ 矢 印 ） 0-B ） 。 pero­xidase staining.（ × 70000）。Fig. 2 肝 細 胞核 内 S 抗 原 （ 2・A, B ） 。 δ 抗 原 は 核内 の nuclear particles に 認め る （ 矢 印 ）(2 -B ） 。 free お よ び membrane bound ribosomes 上の S抗 原 （ 2-C ） 。 peroxi­dase staining. （ × 1500, 7500, 21000）。

B 型肝炎ウイルス関連抗原およびδ抗原の肝細胞内局在と病態について : 免疫電顕による検討

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