腸内菌由来Arylsulfate Sulfotransferaseに関する生化学的研究

Abstract

硫酸抱合反応は，種々の水酸基を有する化合物の解毒の主な経路である。この硫酸化を触媒する酵素としてsulfotransferaseが知られており，この酵素は，arylamine，phenol，steroidやbile acidなどの基質の違いにより分類されている。この酵素は硫酸基を3\u27-phosphoadenosine-5\u27-phosphosulfate(PAPS)からアルコール性あるいはフェノール性水酸基に転移する反応を触媒する。最近，同様な酵素が植物，Flaveriaからも見つかっている。そのうち，フェノール性化合物の硫酸化を触媒するphenol sulfotransferase(PST， EC.2.8.2.1)は第2相薬物代謝酵素であり，ヒト組織において種々の薬物，ホルモンのような外因性あるいは内因性物質の硫酸抱合に寄与している。PSTはほ乳動物の肝臓，脳，腎臓や他の組織中に見出されている。ラット肝臓由来のPSTは，その生化学的性質や基質である硫酸受容体に対する至適pHの違いにより4つのグループに分けられている。ヒトの脳では，基質特異性の研究から2つのタイプがみつかっている。さらに，PSTをコードしているcDNAの解析も行われている。ヒトにおいて，dopamineやnorepinephrineのような神経伝達物質は，monoamine oxidase(MAO)やcatechol-O-methyltransferase(COMT)により，不活性化されていると考えられてきた。しかしながら，ヒト脳のPSTがdopamineやnorepinephrineに対して非常に高い親和性をもつことが明らかになってきたことより，catecholarruneの硫酸化はヒト中枢神経系において重要であると考えらるに至った。一方，硫酸抱合はフェノール性化合物の薬理活性の低下（不活性化）あるいは解毒のための代謝過程であると一般に考えられてきた。しかし，脳―腸管ペプチドホルモンとして発見されたcholecyctokinin(CCK)はそのtyrosine残基が硫酸化されている。その活性は非硫酸化体の600倍であり，硫酸化はCCKの薬理学的活性には不可欠である。そのほかにも抗凝血ペプチドであるhirudinや高血圧症治療薬であるminoxidilも硫酸化により活性化される。それゆえに，PSTはフェノール性化合物やtyrosine含有ペプチドの活性化にいままでの役割とは異なる働きをしていると考えられる。しかしながら，硫酸化の生化学的あるいは薬理学的役割が明らかになっているのは数例にすぎない。一方，肝臓で抱合された化合物は，胆汁を経て腸管に達すると，腸内細菌により加水分解，還元あるいは再抱合をうける場合がある。ほ乳類や植物由来のPSTが広く研究されているのに反して，腸内細菌による硫酸化はほとんど研究されていなかった。下剤であるsodium picosulfate は，それ自身では薬効を示さないが，経口投与後に徐々に薬効を発揮する薬物である。Picosulfateの効果は動物種により異なり，またヒトで抗生物質の連続投与により薬効がなくなることから，この薬理作用には腸内細菌由来の酵素による代謝が必要であると推定されていた。検索の結果，ヒト腸内優性菌Eubacteriumが硫酸転移酵素を産生していることを発見した。実際，この酵素はpicosulfateから薬効本体であるphenol体へ反応を触媒した。さらに，従来から知られているPSTの硫酸供与体がPAPSであるのに対して，この硫酸転移酵素はPAPSを硫酸供与体としない新しいタイプの硫酸転移酵素arylsulfate sulfotransferase(ASST，EC.2.8.2.22)であることが明かとなった。この酵素により触媒される硫酸転移反応は，ping pong bi bi mechanismであり，組織由来のPSTとは明かに異なっていた。また，すでにこのASSTはフラボンやタンニン類のポリフェノールの水酸基を位置特異的に硫酸化することを報告している。これらのポリフェノールは植物界に広く分布しており，食品や和漢薬成分として摂取，吸収されれば，肝臓で抱合をうけると推察されてきた。しかし，肝臓で硫酸抱合をうけた後，胆汁に排准されると腸内細菌由来の酵素により他のフェノール性化合物に硫酸基が転移することやさらに硫酸化されることも考えられる。また，摂取したポリフェノールの配糖体はヒトの消化酵素で加水分解されにくいため，腸管下部に達する。それゆえ，細菌性ASSTはこれらポリフェノールの硫酸抱合体の生成にも重要な役割を果たしているのではないかと考えられる。さらに，sulfataseのメカニズムとして，Fendlerはフェノールエステルの硫酸基の加水分解の一次速度定数とそのフェノールのpKaとの間に直線関係があることを報告している。このことより，硫酸供与体のpKaが硫酸転移酵素の活性に影響している可能性が考えられる。また，一般に基質に対する酵素の親和性は反応溶液のpHの影響をうけると報告されている。我々は硫酸受容体基質の違いにより，ASST活性のpH profileが異なることを報告しているので，さらに基質のpKaの違いとASST活性の関係を研究する必要があると考える。先に記したようにヒトの脳や血小板由来のPSTは，その基質特異性からmonoamine sulfating PST(M-PST)とphenol sulfating PST(P-PST)の2 種に分類されている。また，この2種のPSTは特異的阻害剤であるdichloronitrophenolに対しての感受性が異なることも知られている。ヒト脳のM-PSTとP-PSTの反応機構の実験より，最終産物である3\u27-adenosine5\u27-p hosphate(3\u27,5\u27-PAP)とPAPSの類似体であるATPが本酵素活性を競合的に阻害することが報告されている。また，ヒト赤血球中にはPSTの内因性限害剤が高分子体と低分子体として存在することが示されている。このうち，高分子のものは，PAPS分解酵素であり，低分子はATPやADP，3,5\u27-PAPのようなPAPSの構造類似体である。このように，組織由来のPSTでは，特異的阻害剤が発見され，また，内因性の阻害物質も見つかっており，これらの化合物による酵素活性の生体内制御機構も考えられているが，腸内菌由来のASSTに関しては，特異的な阻害物質あるいは活性化物質はまだ見つかっていない。今回，ASSTの生化学的性質を研究するために，抗体カラムを用いて精製方法の簡便化を試み，第一章に結果を記した。また，種々の薬物や内因性物質，ペプチド，生薬成分に含まれる配糖体の酵素的硫酸化を行い，硫酸化による薬理活性の変化やチロシン残基の硫酸化による生化学的変化を検討し，二ヶ以上のフェノール性残基を持つdopamineやesculetinについては酵素的硫酸化体の構造決定を行った。以上のことを第二章に詳述した。さらに，基質であるフェノール性化合物のpKa値と硫酸化活性の相関を求め，第三章に記した。本酵素の活性調節物質を調べるために，本研究では阻害物質の検索と金属イオンやヌクレオチドの影響を検討し，第四章に示した。またラット腸内菌Klebsiellaよりも，硫酸転移酵素を分離しえたので，その硫酸化反応機構を検討し，第五章に示した。富山医科薬科大学・博士(薬学)・乙第273号・今村理佐・1995/3/1富山医科薬科大