Comparativa de pipelines de análisis computacional para la detección de transcritos con uso diferencial

Trabajo de fin de máster en Bioinformática y Biología ComputacionalLa detección de transcritos que sufren switching (cambios en la proporción de isoforma entre distintas condiciones) puede aportar mucha información funcional sobre lo que está ocurriendo en el organismo en un determinado momento: puede que, sin necesidad de que la expresión total del gen varíe o no lo haga en grandes cantidades, se produzca un cambio en la selección de una isoforma respecto a otra. Por este motivo, y debido a la ausencia de un pipeline estandarizado para su análisis, se decidió realizar un benchmarking entre las distintas condiciones para comprobar el funcionamiento de cada una de ellas en unas condiciones no limitantes. Para ello, se realizó una simulación de lecturas con el paquete de Polyester, de la manera que fueran lo más similares a las biológicas posibles, incluído su variabilidad y sesgos de los métodos de secuenciación más utilizados. Posteriormente, estas lecturas se alinearon mediante dos alineadores especializados en el RNA-seq, STAR y Salmon, que además presentan tiempos de ejecución más cortos que los modelos más antiguos y permiten favorecer estos estudios. La posterior reconstrucción de isoformas y su cuantificación es un paso incluído en Salmon ya que realiza un quasi-mapeo de las lecturas y a partir de él realiza la cuantificación de cada isoforma. En el caso del alineador STAR, estas proporciones se estiman mediante RSEM, método que utiliza el algoritmo de esperanza maximización. Por último, para realizar el análisis de la expresión diferencial de porcentajes de isoformas (switching) se utilizó DRIMSeq, un paquete de R muy actual que permite la estimación de isoformas; SUPPA, un método utilizado clásicamente para el análisis de cambios en eventos de splicing y ASApp, programa desarollado por la unidad de bioinformática del CNIC. Para poder realizar todos estos pipelines de manera completa, se desarrollaron scripts en R y bash que permiten la automatización de cada uno de los pasos y la adaptación de las salidas de uno de los programas para actuar como entrada en la siguiente. Esto, junto al uso del paquete de importación de R tximport se obtuvieron los resultados del rendimiento y capacidades de cada uno de los pipelines. Mediante el cálculo de los cambios en la proporción de isoformas calculadas (log2 Fold Change) para cada uno y la cuantificación del número de lecturas por cada isoforma que nos aporta Polyester como las verdaderas (ground truth), se pudo calcular el error cuadrado de la media para ver la precisión en la estimación de estas proporciones. Se vio que el mejor paquete en cuanto a desviación era RSEM-AsApp, seguido de Salmon-DRIMSeq. Sin embargo, cuando evaluamos la capacidad de detección de isoformas que sufren switching por medio de una curva ROC, vemos que DRIMSeq queda muy por detrás ya que no es capaz de alcanzar grandes valores de sensibilidad, cometiendo una gran cantidad de falsos positivos y falsos negativos. Por otro lado, RSEM-ASApp presenta la mejor curva, concordando con su resultado de MSE, a pesar de la gran cantidad de falsos positivos que introduce en comparación con Salmon-ASApp, debido a que también presenta una gran cantidad de verdaderos negativos, este efecto se ve diluido. Por último, se propone que incrementando la restricción en la determinación de los límites de clasificación de ASApp junto con el pipeline de RSEM podría mejorar el rendimiento conjunto de esta, ya que la estimación de las proporciones sí que son muy acertadas a pesar de que considera como switching algunos de los transcritos que no lo sufren

El CITA inicia una investigación que integra la nutrigenómica en la producción animal

Esta nueva investigación pretende avanzar en el conocimiento de la base genética, e interacción gen‐nutriente, y de los mecanismos moleculares implicados en el contenido en vitamina E en la carne de corderos tipo ternasco, con el fin de conocer los mecanismos que influyen en la obtención de una carne con mayor contenido de vitamina E

Regulación del metabolismo secundario en hongos

El género Fusarium engloba cientos de especies de hongos saprófitos y patógenos ampliamente distribuidos en la naturaleza. Muchos son económicamente importantes por sus efectos dañinos en la agricultura, y otros poseen especial interés por la complejidad de su metabolismo secundario. Dicho metabolismo incluye la producción de compuestos de interés biotecnológico, como las giberelinas y los carotenoides. Nuestro grupo centra actualmente su atención en los mecanismo moleculares que controlan la síntesis de carotenoides en las especies F. fujikuroi y F. oxysporum. Se han identificado todos los genes de esta ruta biosintética (genes car) y al menos dos factores ambientales que modulan su expresión, la luz y la disponibilidad de nitrógeno. La organización genómica de los genes car indica dos funciones diferentes: la producción de una xantofila, la neurosporaxantina, y de una rodopsina, CarO. La producción de CarO fotoactiva requiere la síntesis tanto de la opsina como de su cromóforo, el retinal. Los cuatro genes necesarios para la producción de CarO y retinal están organizados en Fusarium en un cluster en cuya regulación participan al menos dos proteínas fotoreceptoras y una proteína de la familia RING finger, llamada CarS, que actúa como regulador negativo. Indicios cada vez más sólidos respaldan la participación en el mecanismo de regulación por luz y por la proteína CarS de ARNs no codificantes ubicados en una región intergénica anterior al propio gen carS. Las investigaciones se centran actualmente en desentrañar las bases moleculares del mecanismo de regulación mediado por CarS y ARNs no codificantes y su participación en otros procesos celulares, delatados por análisis de transcriptómica global.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Análisis molecular y funcional de los transportadores de amonio (AMT) en pino marítimo (Pinus pinaster)

En los bosques de coníferas la mayor parte del nitrógeno inorgánico disponible se encuentra en forma de amonio como fuente primaria de nitrógeno asimilable [1]. El amonio se incorpora por las raíces a través de proteínas de transmembrana denominadas transportadores de amonio (AMT). En nuestro laboratorio se ha llevado a cabo estudios de transcriptómica en diferentes órganos de la conífera modelo Pinus pinaster y bajo diferentes condiciones nutricionales con amonio como fuente de nitrógeno [2]. Los resultados obtenidos se han recogido en una base de datos denominada EuroPineDB (http://www.scbi.uma.es/pindb/) en la que se han identificado 5 isogenes de la familia AMT, 3 isoformas perteneciente a la subfamilia 1: PpAMT1;1, PpAMT1;2 y PpAMT1;3 y 2 pertenecientes a la subfamilia 2: PpAMT2;1 y PpAMT2;2. Nuestro grupo ha comenzado la caracterización molecular de estos genes y se han realizado estudios comparados con angiospermas. Como primera aproximación se han determinando los niveles de expresión y la distribución de transcritos en diferentes órganos de la planta, en diferentes estadios de desarrollo y bajo diferentes condiciones nutricionales. Además, se han realizado construcciones de las correspondientes proteínas recombinantes para estudiar las características bioquímicas de las diferentes isoformas mediante expresión heteróloga en levadura. Los resultados obtenidos indican que los genes AMT de pino se expresan de forma diferencial en distintos órganos de la planta y las proteínas que codifican difieren en sus características moleculares y parámetros cinéticos. En conjunto, nuestros resultados sugieren que los miembros de la familia génica AMT de pino desempeñan funciones diferentes en el transporte de nitrógeno de esta conífera. Bibliografía [1] Cánovas et al. (2007) Journal Experiment Botany 58: 2307–2318. [2] Canales et al. (2010) Amino Acids 39, 4: 991-1001.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Aproximación funcional al efecto supresivo de la cáscara de almendra compostada aplicada al cultivo del aguacate

La podredumbre blanca de la raíz, causada por el hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix, es uno de los problemas más graves del cultivo del aguacate en el área mediterránea. Desde hace años, el manejo integrado de la enfermedad ha incluido la aplicación de enmiendas orgánicas como estrategia para mejorar el estado fitosanitario de los suelos agrícolas. En este trabajo, se llevaron a cabo ensayos “in vitro” frente a R. necatrix para evaluar la capacidad supresiva de los suelos enmendados con cáscara de almendra compostada, así como la implicación de la microbiota del suelo en la misma. Los resultados muestran que la adición de cáscara de almendra compostada al suelo, causa un aumento de la supresividad frente a R. necatrix asociada a la microbiota. El uso de técnicas de genómica molecular nos ha permitido conocer la composición y el potencial funcional de la microbiota de estos suelos. Estos análisis revelaron el predominio en la comunidad microbiana de representantes de los phyla Proteobacteria y Acidobacteria (que suponen más del 50% de las cepas bacterianas identificadas) y del phylum Ascomicota (40% de representantes fúngicos). Por otro lado, el uso de un microarray comercial (GeoChip), mostró la activación del ciclo del carbono a diferentes niveles y su implicación en la selección de grupos concretos de microorganismos, como los representantes de la clase Gammaproteobacteria. Finalmente, hemos realizado el aislamiento y caracterización de microorganismos cultivables con el fin de determinar su participación en el biocontrol de la enfermedad, lo que nos permitirá profundizar en el conocimiento de los posibles mecanismos implicados en la supresividad mediante técnicas de transcriptómica y proteómica.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

The cocoa genome hub, an integrated platform to access the Criollo genome V2

The first draft genome of the species, from the Belizian Criollo B97-61/B2 cultivar, was published in 2011. Although a useful resource, some improvements were possible, including to identify misassemblies, to reduce the number of scaffolds and gaps, and to anchor un-anchored sequences to the 10 chromosomes. In 2017, we used a combination Next Generation Sequencing data to produce the version 2 of the assembly. We corrected misassembled regions and reduced the number of scaffolds from 4,792 in assembly V1 to 554 in V2 with a N50 increased from 0.47 Mb in V1 to 6.5 Mb in V2. A total of 96.7% of the assembly was anchored to the 10 chromosomes compared to 66.8% in the previous version. Unknown sites (Ns) were reduced from 10.8% to 5.7%. In addition, we updated the functional annotations and performed a new RefSeq structural annotation based on RNAseq evidence. In that context and to support post-genomics efforts, we developed the Cocoa Genome Hub (http://cocoagenome- hub.southgreen.fr/), an integrated web-based database providing centralized access to T. cacao genome and analysis tools to facilitate basic, translational and applied research in cocoa. We provide access to the complete criollo genome sequence V2 along with gene structure, gene product information, metabolism, gene families, transcriptomics (ESTs, RNA-Seq), genetic markers and genetic maps. The hub relies on generic software (e.g. GMOD tools) for easy querying, visualizing and downloading research data. It includes a Genome Browser enhanced by a Community Annotation System, enabling the improvement of automatic gene annotation through an annotation editor. (Résumé d'auteur

Caracterización transcriptómica de células troncales mesénquimales inducidas a diferenciarse en adipocitos

Premio extraordinario de Trabajo Fin de Máster curso 2013-2014. Investigación Biomédica Traslacional.La inducción de la diferenciación de células troncales mesenquimales (MSC) en adipocitos supone un complejo y altamente organizado programa de expresión génica. Son muchos los estudios realizados en este campo con el fin aumentar el conocimiento del desarrollo de la adipogénesis, incluyendo todas las vías y factores que influyen en la determinación de que las células MSC se diferencien en adipocitos. La comprensión del proceso adipogénico y su regulación tiene una gran relevancia para el conocimiento de los procesos implicados en enfermedades como la obesidad y la diabetes, las cuales en los últimos tiempos son consideradas como epidémicas a nivel mundial. Con el objeto de profundizar en el conocimiento del proceso de diferenciación adipogénica, en el presente estudio hemos determinado mediante expresión diferencial a nivel de transcriptoma, genes, funciones moleculares y vías metabólicas implicados en el proceso de diferenciación de MSC a adipocitos in vitro. Los resultados muestran como la vía del factor de transcripción PPARγ es la que principalmente se activa durante la adipogénesis