Analytik, Toxikologie und Toxizität von freigesetzten Inhaltsstoffen aus dentalen Materialen

Aufgrund ihrer ästhetischen und physikalischen Eigenschaften sind dentale Komposite das meist verwendete Zahnfüllungsmaterial. Dentale Komposite auf Methacrylatbasis bestehen aus verschiedenen (Co)Monomeren (Methacrylaten) und Additiven [1, 7]. Wegen der unvollständigen (Co)Monomer-Polymer-Umwandlung wird eine Freisetzung von unpolymerisierten (Co)Monomeren und Inhaltstoffen aus den dentalen Kompositen beschrieben [210, 230]. Diese können über die Dentintubuli mit der Pulpa in Kontakt kommen, die Aktivität der Zahnpulpa-Zellen beeinträchtigen oder durch Verschlucken in den Darm gelangen, wo sie in den Blutkreislauf und die Organe geraten können [8-10]. Außerdem wird über allergische Reaktionen wie Asthma und Kontaktdermatitis berichtet, die durch Methacrylate verursacht werden [20]. Es gibt zahlreiche In-vitro-Studien zur Toxizität und Biokompatibilität, die gezeigt haben, dass einige der eluierten (Co)Monomere und Additive östrogene, mutagene, teratogene und genotoxische Wirkungen haben [29, 81, 231, 232]. Zur Bestimmung der Freisetzung von (Co)Monomeren und Additiven aus dentalen Kompositen werden polymerisierte Kompositprüfkörper in Extraktionsmedia Methanol oder Wasser eluiert. Mittels GC/MS lassen sich anschließend die freigesetzten Inhaltsstoffe qualifizieren und quantifizieren. Trotz der Einhaltung der vom Hersteller empfohlenen Polymerisationszeiten ist der relativ niedrige Polymerisationsgrad (DC) von dentalen Kompositen ein Grund für die Freisetzung von Inhaltsstoffen aus Kompositen. Dieser liegt nur etwa bei 55-65% [64]. Um die Polymerisationsschrumpfung zu reduzieren und eine ausreichende Durchhärtungstiefe zu erreichen sowie die Freisetzung von Kompositinhaltsstoffen aus konventionellen Kompositmaterialen zu reduzieren wird bisher für Schichtdicken > 2 mm die sogenannte Inkrementschichttechnik bei posterioren Kompositrestaurationen mit einer maximalen Schichtdicke von 2 mm oder weniger angewendet [54]. Die Entwicklung von Bulk-Fill Kompositen verspricht eine Beschleunigung des Restaurationsprozesses, durch die Möglichkeit der Aushärtung einer bis zu 4 mm dicken Schicht in einem Schritt [55] und somit in vielen Fällen die Füllung einer kompletten Kavität [56, 57]. Inwieweit sich eine Schichtdicke von bis zu 6 mm (entgegen der Herstellerempfehlung) im Vergleich zu einer Schichtdicke von 2 und 4 mm (gemäß Herstellerangaben) auf die Menge an eluierbaren Inhaltsstoffen aus Bulk-Fill Kompositen auswirkt, wurde in der vorliegenden Studie [44] mit den Kompositen SDR Bulkfill, Venus Bulkfill und ELS Bulkfill untersucht. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie [44] zeigen, dass die Herstellerangaben strikt befolgt werden sollten, da in vielen Fällen eine laut Hersteller nicht freigegebene Schichtdicke von 6 mm zu einer höheren Menge an eluierten Bulk-Fill Kompositinhaltsstoffen führt. Dies kann zu einer höheren Exposition bei Patienten führen. Die Menge an eluierten (Co)Monomeren und deren Wiederfindungsrate ist von dem zur Extraktion verwendeten Medium abhängt. So ist z.B. die Wiederfindungsrate im Zellkulturmedium mit fötalem Kälberserum aufgrund des hohen Anteil an Proteinen geringer [92]. Für die Beurteilung der Toxizität und Biokompatibilität von Dentalkompositen ist es nicht nur wichtig zu wissen, welche (Co)Monomere und Additive in welcher Menge freigesetzt werden, sondern ob diese Stoffe auch an Proteine binden können. Diese Proteinbindung könnte in vivo zu einer reduzierten Bioverfügbarkeit führen [93]. In der vorliegenden Studie [45] wurde die Bindung von freisetzbaren Inhaltsstoffen aus den Kompositen Admira flow, Venus Diamond flow, Filtek Supreme XTE flow, Tetric EvoCeram und Tetric EvoFlow an Speicherproteinen untersucht. Als Extraktionsmedien wurden nativer Speichel (mit Proteinen), proteinfreier Speichel, Wasser und Ethylacetat für die Elutionsversuche verwendet. Neben der Kenntnis der Bindung von (Co)Monomeren an Speichelproteine ist auch die Bindung an Plasmaproteine wichtig, um die Toxizität von Dentalmaterialien zu beurteilen. Daher wurde auch die Bindung einiger Methacrylate und Additive an die Plasmaproteine human serum albumin (HSA) und human α1-acid glycoprotein (AGP) untersucht. So konnte gezeigt werden, dass künstlicher Speichel bzw. Wasser als Extraktionsmedium nicht die tatsächliche physiologische Situation im Körper widerspiegeln [45]. Die Konzentration an (Co)Monomeren und Additiven, die in nativem Speichel freigesetzt werden, ist deutlich niedriger als die Konzentration, die in proteinfreiem Speichel bzw. Wasser freigesetzt wird. Speichel- und Plasmaproteine können (Co)Monomere und Additive binden und dadurch zu einer geringeren Bioverfügbarkeit von freigesetzten Inhaltsstoffen in vivo als bisher angenommen führen. Allerdings ist die Bindung von Wirkstoffen und wohl auch von freigesetzten Inhaltsstoffen aus Kompositen an Proteine in der Regel reversibel [45, 112]. Neben Veneers und zahnfarbenen Kronen ist zum Beispiel Bleaching das häufigste Verfahren, um die Zähne ästhetisch zu verschönern [116]. Hierfür gibt es drei verschiedene Standard-Bleichmethoden, die auf Carbamid- oder Wasserstoffperoxid-Gel basieren. 1. In-Office-Bleaching-Methoden (35% Peroxide) bzw. Chairside-Bleaching-Methoden (38% Peroxide) [118], 2. Home-Bleaching-Methoden (15% Peroxide) [119] und 3. rezeptfreie Produkte (Over-the-counter-Produkte) (maximal 10% Peroxide). Bleichschienen zum Auftragen des Bleichgels werden nur beim Home-Bleaching und beim In-Office-Bleaching verwendet [120]. Werden jedoch bei einem Patienten vor einem Bleichvorgang insuffiziente Restaurationen festgestellt, müssen diese in jedem Fall vor Beginn des Bleichvorgangs ausgetauscht werden, da es beim Kontakt der Bleichgele mit der Pulpa zu einer Schädigung der Pulpazellen kommen kann [126]. In den vorliegenden Studien [46, 47] wurden daher der Einfluss von Bleaching-Behandlungen mit den Opalescence-Bleichgelen PF 15% (PF 15%) (Home-Bleaching) und PF 35% (PF 35%) (In-Office-Bleaching) auf die Freisetzung von Kompositinhaltsstoffen aus den konventionellen Kompositen Tetric EvoCeram, CLEARFIL AP-X, Tetric EvoFlow, Filtek Supreme XT, Ceram X mono+, Admira und Filtek Silorane, und den Bulk-Fill Kompositen Tetric EvoCeram Bulk Fill, QuiXFil und X-tra fil untersucht. Für die untersuchten konventionellen und Bulk-Fill Komposite konnte gezeigt werden, dass die Elution von Inhaltsstoffen nach dem Bleichprozess von der Zusammensetzung des jeweiligen Komposits abhängig ist, also Bleichbehandlungen sowohl zu einer verringerten als auch zu einer erhöhten Elution von Inhaltsstoffen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle führen können [46, 47]. Der 3D-Druck (additive Methode) ist eine neuere Technologie, bei der im Gegensatz zu industriell vorgefertigten Fräsblöcken flüssige bzw. niedrigvisköse Materialien verwendet werden. Da diese neuartigen, für den 3D-Druck entwickelten Materialien je nach Verfahren eine bestimmte Zusammensetzung erfordern, gibt es bisher nur wenige Erkenntnisse über ihre Biokompatibilität und andere Eigenschaften [153]. Während einige Studien Elutionsdaten für konventionelle und vorgefertigte Fräsmaterialien erheben [165, 166], finden sich nur sehr wenige Untersuchungen für additiv verarbeitete Materialien [3]. Ziel der vorliegenden In-vitro-Studie [4] war daher, die Elution/Freisetzung von Inhaltsstoffen aus drei verschiedenen methacrylharzbasierenden PMMA-Materialien, die für die Herstellung von Zahnschienen im additiven (3D-Druck, SHERAprint-ortho plus), subtraktiven (Fräsen, SHERAeco-disc PM20) und konventionellen Verfahren (Pulver und Flüssigkeit, SHERAORTHOMER) verwendet werden, sowie deren zytotoxisches Potenzial unter Berücksichtigung physiologischer Schienengrößen zu untersuchen. Die Ergebnisse der vorliegenden in vitro Studie [4] zeigten, dass derzeit industriell vorgefertigte Polymerrohlinge für die subtraktive Fertigung (SHERAeco-disc PM20) in Bezug auf die Biokompatibilität überlegen sind. Neu entwickelte Werkstoffe für die additive Fertigung scheinen eine komplexere Zusammensetzung aufzuweisen und damit das Potenzial für eine Elution einer größeren Anzahl von (Co)Monomeren und Additiven zu haben. Die freigesetzten Inhaltsstoffe im Elutionsmittel Methanol aus den untersuchten Schienenmaterialien überstiegen die zytotoxischen Konzentrationen in HGFs, die für ein „Worst-Case“-Szenario in der physiologischen Schienengröße berechnet wurden. In den Wassereluaten konnte dagegen nur das Methacrylat Tetrahydrofurfuryl methacrylat (THFMA) aus SHERAprint-ortho plus in Konzentrationen unterhalb zytotoxischer Werte in HGFs bestimmt werden. Daher ist das Gesundheitsrisiko in der physiologischen (Wasser/Speichel) Situation von geringer Bedeutung. Die (Co)Monomere Triethylenglycoldimethacrylat (TEGDMA), 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) können aus den unvollständig polymerisierten Kompositmaterialien freigesetzt werden [1] und dadurch die Aktivität von Pulpa-Zellen beeinträchtigen oder durch Verschlucken in den Darm gelangen und anschließend den Blutkreislauf und die Organe erreichen [1, 15]. Die Aufnahme, Verteilung und Ausscheidung von radiomarkiertem 14C-TEGDMA und 14C-HEMA bei Meerschweinchen wurde in unseren früheren Studien untersucht [13, 39]. TEGDMA und HEMA werden zu Methacrylsäure (MA) und darauffolgend hauptsächlich über den sogenannten Epoxyweg metabolisiert [13, 39-41]. In diesem Metabolismus (Epoxyweg) kann die C-C-Doppelbindung von MA oxidiert werden, wodurch der Epoxy-Metabolit 2,3-Epoxy-2-methylpropionsäure (EMPA) gebildet werden kann [29, 42, 43]. Ebenfalls ist sehr wahrscheinlich, dass in vivo der 2,3-Epoxy-2-methyl-propionsäuremethylester (EMPME) gebildet werden kann [29]. Epoxide gelten als hochreaktive Moleküle und mutagene/carcinogene Substanzen [43]. Bisher wurden Studien zur Toxizität und Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen (DNA-DSBs) von den (Co)Monomeren (u.a. TEGDMA und HEMA) durchgeführt [175, 189, 190]. Des Weiteren zeigten Studien, dass die Zugabe von Antioxidantien wie Ascorbinsäure (Asc) bzw. N-Acetylcystein (NAC) die zytotoxische Wirkung und DNA-DSBs von Kompositinhaltsstoffen ((Co)Monomeren) reduzieren können [36-38]. Ob die Comonomer-Epoxy-Metaboliten EMPME und EMPA im Vergleich zu ihren metabolischen Vorläufern TEGDMA, HEMA und dem Zwischenprodukt MA mehr DNA-DSBs in HGFs induzieren können sowie, ob Antioxidantien zur Verringerung von DNA-DSBs in Gegenwart von Comonomer-Epoxy-Metaboliten führen, wurde in der vorliegenden Studie [48] untersucht. Schließlich zeigten die Comonomer-Epoxy-Metaboliten EMPME und EMPA, im Vergleich zu ihrem metabolischen Vorläufer, MA eine höhere Zytotoxizität und induzierten mehr DNA-DSBs. Die Antioxidantien Asc bzw. NAC können die Anzahl der durch EMPME und EMPA induzierten DNA-DSBs in HGFs verringern. NAC wies im Vergleich zu Asc eine bessere Schutzwirkung auf. Bisherige Studien über die durch dentale Kompositmaterialien induzierte Zytotoxizität und DNA-DSBs befassten sich ausschließlich mit den Auswirkungen einzelner Kompositinhaltsstoffe [36, 175, 187]. Versuche mit Komposit-Eluaten, deren Inhaltsstoffen durch vorherige qualitative und quantitative Analyse ermittelt werden, spiegeln möglicherweise eine Situation wider, die der Physiologie näher kommt als Versuche mit einzelnen Kompositkomponenten/-inhaltsstoffen. In der vorliegenden Studie [26] wurde daher die durch dentale Komposit-Eluate resultierende Zytotoxizität und Induktion von DNA-DSBs in HGFs untersucht. Zur Bestimmung der Zytotoxizität und Gentoxizität der Eluate aus den untersuchten Kompositmaterialien EsthetX HD, Venus, X-tra fil, CLEARFIL AP-X, Admira Fusion und QuiXfil wurden XTT- und γ-H2AX-Tests durchgeführt. Die freigesetzten Kompositinhaltsstoffen im Zellmedium Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) wurden mittels GC/MS qualifiziert und quantifiziert, um deren Relevanz als multiple Zusammensetzung aus den freigesetzten Kompositinhaltsstoffen bestmöglich abschätzen zu können. So zeigte die Exposition von HGFs mit den Eluaten von Esthet X HD und Venus eine signifikante Induktion von DNA-DSBs. In allen untersuchten Eluaten wurde keine signifikante Zytotoxizität festgestellt. Interaktive Effekte zwischen den freigesetzten (Co)Monomeren und Additiven können also die Zytotoxizität und die Induktion von DNA-DSBs im Vergleich zur Exposition mit Einzelkomponenten beeinflussen. Die Antioxidantien Asc und NAC gelten als Radikalfänger [196] und können in vitro durch TEGDMA und HEMA induzierte Zytotoxizität sowie die Genotoxizität von dentalen (Co)Monomeren und ihren Epoxymetaboliten EMPA und EMPME verringern [36, 38, 48, 216, 217]. Oral verabreichte Mischungen von Antioxidantien, einschließlich Asc und NAC, können durch ionisierende Strahlung induzierte DSBs reduzieren [199]. In der vorliegenden Studie [49] wurden die Antioxidantien Asc bzw. NAC (1, 0,1 und 0,01 Gew.-%) als neue/zusätzliche Kompositkomponente in den drei lichthärtenden Kompositmaterialien Venus, Grandio und Filtek supreme XTE hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf den Polymerisationsgrad (DC) und die Elution von Kompositinhaltsstoffen untersucht. Zusätzlich wurde die Freisetzung von Asc bzw. NAC mittels „high-performance liquid chromatography/diode array detection“ (HPLC/DAD) und „high-performance liquid chromatography/fluorescence detection“ (HPLC/FLD) in diesen neuen Mischungen bestimmt. Beide experimentell eingemischten Antioxidation werden nach der Polymerisation freigesetzt und erreichen entsprechende effektive Konzentrationen zur möglichen Reduktion der Toxizität von (Co)Monomeren und deren Metaboliten. Vor allem NAC hatte im Vergleich zu Asc einen geringen Einfluss auf den DC. Dennoch führten beide Antioxidantien teilweise zu einer erhöhten Freisetzung von Inhaltsstoffen der untersuchten Komposite im Vergleich zu Kompositen ohne Antioxidans-Einmischung, wodurch dementsprechend nachteilige toxische Effekte entstehen könnten. Die experimentelle Einmischung von 1 Gew.-% NAC als neue Kompositkomponente in Filtek Supreme XTE hatte keine Auswirkungen auf den DC, die Elution von Kompositinhaltsstoffen und setzte eine effektive Konzentration an Antioxidans frei. Daher stellt Filtek Supreme XTE-1 Gew.-% NAC eine vorteilhafte Mischung dar. Insgesamt erreichen (Co)Monomere und Additive im Speichel des Menschen nach der Elution aus Kompositen maximal nur mikromolare Konzentrationen. Toxische Wirkungen dieser Stoffe treten jedoch meist erst im höheren millimolaren Konzentrationensbereich auf. Für eine exakte Risikoabschätzung eines Schadstoffes sind wissenschaftlich fundierte epidemiologische Untersuchungen unumgänglich. Daher zeigen aus toxikologischer Sicht dentale Komposite, vor allem wenn die Herstellerangaben strikt befolgt werden, eine gute Verträglichkeit. Da die Zusammensetzung von dentalen Materialien stetig verbessert werden, kann es aber trotzdem immer wieder zu Verunreinigungen der Rohprodukte kommen. Deshalb ist eine ständige Kontrolle der eluierbaren Inhaltsstoffe obligatorisch. Ein Teil möglicher unbekannter Inhaltsstoffe ist bis heute noch nicht nachgewiesen und nicht toxikologisch bewertet worden. Für ein tieferes Verständnis des Metabolismus von Abbauprodukten, die aus freigesetzten Inhaltsstoffen gebildet werden und toxische Wirkungen (z.B. Kanzerogenität/Mutagenität) verursachen können, ist ebenfalls die weitere Aufklärung biochemischer Stoffwechselvorgänge, wie z.B. das Alkylierungsverhalten auf DNA-Ebene und eventuelle Möglichkeiten zur Reparatur unumgänglich. Neben den möglichen toxischen Effekten von Inhaltsstoffen aus Zahnmaterialien, stellen allergische Reaktionen/Nebenwirkungen (z.B. Lichen planus, Gingivitis, Ulzerationen, Ekzeme, Erytheme) und Atemwegserkrankungen, für Patienten und zahnärztliches Personal gegenüber Kompositinhaltsstoffen ein Risiko dar. Grundsätzlich ist die Konzentration eines Allergens nicht maßgebend. D.h. bereits geringste Konzentrationen können allergische oder andere Nebenwirkungen hervorrufen. Daher ist es wichtig, alle eluierbaren Bestandteile von Dentalmaterialien zu identifizieren und zu charakterisieren. Darüber hinaus können freigesetzte Kompositinhaltsstoffe zur Bildung von Entzündungsfaktoren führen und/oder das Bakterienwachstum (Parodontitis) beeinflussen [104]. Deshalb ist der Nachweis solcher Substanzen und die Aufklärung der daraus resultierenden Stoffwechselvorgänge von aktueller Bedeutung

Struktur und Funktion des Lichtsammelkomplexes LHC-II der höheren Pflanzen

Der Lichtsammelkomplex II (LHC­II) dient als Lichtantenne für das photosynthetische Reaktionszentrum II der höheren Pflanzen. Seine Trimere stellen das häufigste Protein in der Thylakoidmembran dar. Ungefähr die Hälfte des Chlorophylls der Pflanze befindet sich in diesem Komplex. Der LHC­II ist ein integrales Membranprotein und bindet neben Chlorophyll a und b auch verschiedene Carotinoide. Seine Pigmente absorbieren Licht und geben die dadurch aufgenommene Energie an die photosynthetischen Reaktionszentren weiter, wo sie ausgehend von einer Ladungstrennung chemisch konserviert wird. Die Weiterleitung der Anregungsenergie im LHC­II geschieht über spezifische Pfade und mit ultraschneller Kinetik im Femtosekundenbereich. Der LHC­II ist das einzige Antennenprotein der höheren Pflanzen, dessen dreidimensionale Struktur bei einer fast atomaren Auflösung von 3.4Å gelöst wurde. Bei dieser Auflösung war es jedoch nicht möglich, den Unterschied zwischen Chlorophyll a und b zu bestimmen, außerdem waren nur zwei der insgesamt drei bis vier gebundenen Carotinoide sichtbar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die einzelnen Pigmente, deren Positionen aus der Struktur bekannt waren, nach ihrer chemischen Natur zuzuordnen. Hierzu wurden mutierte Komplexe untersucht, bei denen jeweils ein bestimmtes Chlorophyllmolekül fehlte. Dies wurde durch Punktmutationen im Polypeptid erreicht, bei denen diejenige Aminosäure ausgetauscht war, an die ein bestimmtes Chlorophyllmolekül über das zentrale Mg 2 Atom gebunden war. Die veränderten Proteine wurden durch ortsgerichtete Mutagenese und Überexpression des Polypeptids in E. coli hergestellt, wo sie ohne die Pigmente aggregiert in Einschlusskörpern vorlagen. Die Rückfaltung in Gegenwart von Pigmenten und Detergenzien erfolgte auf einer Nickel­Affinitätssäule, an die das LHC Protein mittels einer Hexa­Histidinmarkierung gebunden war. So konnte in einem biochemischen Schritt das Protein gefaltet, die Pigmente inkorporiert und die native, trimere Form gebildet werden. Die Rückfaltung von histidinmarkierten Proteinen auf Metallaffinitätssäulen kann als generelle Methode auch für andere, schwierig zu faltende, lösliche und Membranproteine angewandt werden. Der native Zustand des rückgefalteten LHC­II wurde folgendermaßen bewiesen: Der Pigmentgehalt, der durch HPLC Analyse bestimmt worden war, war identisch zum nativ isolierten Protein. Auch ein Absorptionsspektrum zeigte bei 4K die charakteristische Aufspaltung in mehrere Chlorophyllmaxima. Es konnte gezeigt werden, dass in einem Fluoreszenzexperiment die Anregungsenergie, die bei kurzwelligem Chlorophyll b eingestrahlt wurde, im Komplex komplett auf das langwelligste Chlorophyll a übertragen wurde. Schließlich wurden aus dem rekombinanten Protein zwei­dimensionale Kristalle erzeugt, deren elektronenmikroskopische Projektionsbilder identisch zu denen des Nativproteins waren. Der Austausch der Chlorophylle an einigen Bindungsstellen durch Chlorophyllderivate, die entweder im Zentralatom oder in der Porphyrinringstruktur verändert waren, zeigte, dass das Zentralatom den entscheidenden Faktor zur Stabilisierung der Chlorophyllbindung darstellt. Es wurden neun Mutanten erzeugt, bei denen jeweils derjenige Aminosäurerest ausgetauscht war, von dem aus der Struktur bekannt war, dass er den fünften Liganden für das zentrale Mg 2 Atom eines bestimmten Chlorophylls darstellt. Die HPLC Analyse ihrer Pigmente zeigte, dass die Mutanten tatsächlich jeweils ungefähr ein Chlorophyllmolekül verloren hatten; dies diente dazu, die jeweilige Bindungstasche zu Chl a oder Chl b zuzuordnen. Nur sechs Mutanten bildeten Trimere, ihre biochemischen Daten zeigten, dass die in der Struktur vorgenommene Zuordnung bis auf das Chl b3 korrekt war. Einige Chlorophyllmutanten waren auch in ihrem Gehalt an Neoxanthin reduziert, daraus konnte die ungefähre Lage des Neoxanthins in der Nähe der Helix C abgeleitet werden. Die mutierten Proteine lieferten nicht nur die Zuordnung einer Bindungstasche zu einem bestimmten Chlorophylltyp, sondern es konnte aus den Differenzspektren im Vergleich zum Wildtyp auch die Wellenlänge eines bestimmten Chlorophylls abgeleitet werden. Um eine höhere spektrale Auflösung zu erzielen, wurden die Spektren bei 4K aufgenommen. Die Zuordnung einzelner spektraler Banden zu bestimmten Chlorophyllen zeigte, dass in einer bestimmten Bindungstasche nur entweder Chlorophyll a oder Chlorophyll b gebunden war, da sich nur eine einzige Differenzbande im Spektrum ergab. Weiterhin implizieren die gefundenen Einzelbanden, dass die Pigmente keiner starken excitonischen Kopplung unterliegen, wie dies zum Beispiel im B850 Ring des bakteriellen Lichtsammelkomplexes der Fall ist. Bei LHC­II Komplexen, die nur mit Chlorophyll b rückgefaltet worden waren, zeigte sich eine ungewöhnlich langwellige Fluoreszenz bei 77K. Dies könnte auf eine räumlich limitierte Kopplung eines einzelnen Chlorpohyllpaars hinweisen. Bei der Mutante der Chl a2 Bindungsstelle zeigte sich, dass dies das langwelligste der untersuchten Pigmente war. Der zugehörige Koomplex war auch der einzige, bei dem die Fluoreszenz ins Kürzerwellige verschoben war. Die Lage des Chlorophylls a2 an der Außenseite des Proteins ist prädestiniert für die Energieübertragung zum photosynthetischen Reaktionszentrum oder zu benachbarten LHC Komplexen

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Cystein-Mutanten der Cu,Zn-Superoxiddismutase und ihre Anwendung in Proteinelektroden für die Detektion von freien Sauerstoffradikalen

Das Enzym Superoxiddismutase (SOD) bietet wegen seiner hohen Reaktionsrate und seiner extrem hohen Substratspezifi tät große Vorteile für eine Anwendung als Superoxidbiosensor. In dieser Arbeit wurden durch molekularbiologische Methoden Mutanten der humanen Cu,Zn-SOD gewonnen, welche ein oder zwei zusätzliche Cystein-Reste enthielten, die eine einfache Immobilisierung des Proteins durch Bindung des Cystein-Schwefels auf Goldelektroden ermöglichten. Sechs solcher Mutanten wurden entworfen, exprimiert, aufgereinigt und elektrochemisch charakterisiert. Alle Mutanten konnten durch einen einfachen Inkubationsschritt auf Goldelektroden gebunden werden und zeigten ein quasi-reversibles elektrochemisches Ansprechen. Für eine Mutante wurde die Anwendung als Superoxidsensor genauer untersucht und für beide Teilreaktionen der Dismutation ein Ansprechen des Sensors auf das Radikal gefunden. Bei Verwendung einer Teilreaktion konnte die Empfindlichkeit herkömmlicher Monoschichtsensoren um etwa eine Größenordnung übertroffen werden