Microscopia confocale nella valutazione del trattamento con Ciclosporina topica nella Sindrome di Sjogren primitiva.

Negli ultimi anni l'efficacia della Ciclosporina topica nel trattamento del dry eye in pazienti affetti da Sindrome di Sjogren primaria è stata dimostrata mediante numerosi trials clinicibasati su test di funzionalità lacrimale utilizzati di routine nell'esame delle disfunzioni della superficie oculare. Con questo studio ci siamo prefissati di indagare i cambiamenti morfologici corneali indotti dalla ciclosporina topica all'1,2% in un gruppo di pazienti affetti da Sindrome di Sjogren primaria (pSS). Abbiamo incluso nel nostro studio pazienti che erano stati sottoposti a microscopia confocale (CSLM) in entrambi gli occhi durante la prima visita presso il nostro centro e dopo sei mesi di trattamento con ciclosporina topica. Le immagini del CSLM sono state esaminate da un unico operatore che ha valutato parametri quali l'integrità dell'epitelio basale, la pachimetria, l'attivazione cheratocitaria, la densità,tortuosità e reflettività del plesso nervoso sub-basale. Questi parametri sono inoltre stati raffrontati ai dati demografici, clinici e sierologici dei pazienti ed in particolare ai test di routine utilizzati nella valutazione del dry eye quali test di Shirmer I, test di captazione con verde di Lissamina (LGS) e BUT basali e dopo 6 mesi di trattamento con CsA. Sono stati riscontrati degli incrementi statisticamente significativi all'esame con LSCM in integrità dell'epitelio basale (p<0.001), pachimetria (p<0.006), attivazione cheratocitaria (p<0.001), densità delle cellule epiteliali superficiali (p=0.006) e basali (p=0.017), densità(p=0.01), tortuosità (p=0.02) e reflettività (p=0.005) delle fibre nervose corneali sub-basali. In conclusione il trattamento con CsA topica all'1,2% di pazienti affetti da pSS ha dimostrato un miglioramento statisticamente significativo dei parametri morfologici corneali esaminati con CSLM

Transport de nanovecteurs dans des matrices complexes

Avec le développement des nanomédecines, le transport des nanovecteurs (à vocation thérapeutique ou diagnostique) et leur capacité à pouvoir franchir ou non des barrières biologiques sont devenus des champs de recherche très actifs [1, 2]. Ces barrières peuvent être des hydrogels. Elles sont alors constituées d\u27une matrice macromoléculaire complexe, leur conférant une tenue mécanique, baignée par une phase aqueuse. Ce fluide joue un rôle majeur dans le transport et, lorsqu’il est à l\u27arrêt, le mouvement des nanovecteurs résulte uniquement de l’agitation thermique. Comprendre les relations entre la structure de la matrice, ses interactions avec les nanovecteurs et leur diffusion est l\u27objectif de mes recherches à Angers. Il constitue un défi scientifique en physico-chimie mais contribue également à une conception plus rationnelle des matrices et/ou des nanovecteurs dans le but d’applications ciblées. Ce projet combine une approche expérimentale et numérique sur la diffusion de nanovecteurs à travers des hydrogels biologiques d’intérêt (mucus, matrice extra-cellulaire, surfactant pulmonaire, coupes organotypiques, hydrogels synthétiques...). Il nécessite le développement de méthodologies expérimentales nouvelles sur le site d’Angers, en collaboration avec le SCIAM et PRIMEX : Microscopie confocale en mode FRAP et « particle tracking ». RMN à gradient de champ. Diffusion de la lumière en milieu turbide. Ces techniques permettent une mesure fiable du coefficient de diffusion, in situ, dans la matrice sans recourir aux techniques plus classiques de mesure de perméation. Les expériences de microscopie confocale permettent également de quantifier les phénomènes d’adsorption et de convection au sein de la matrice. Au-delà de l’unité MINT, le développement de ces techniques peut intéresser d’autres équipes sur le site. 1.            Nance, E.A., Woodworth, G.F., Sailor, K.A., Shih, T.-Y., Xu, Q., Swaminathan, G., Xiang, D., Eberhart, C., and Hanes, J., A Dense Poly(Ethylene Glycol) Coating Improves Penetration of Large Polymeric Nanoparticles Within Brain Tissue. Science Translational Medicine, 2012. 4(149): p. 149ra119. 2.            Lai, S.K., Wang, Y.-Y., and Hanes, J., Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Advanced Drug Delivery Reviews, 2009. 61(2): p. 158-171.

VIDÉO-MICROSCOPIE SANS LENTILLE POUR LA BIOLOGIE CELLULAIRE 2D ET 3D

International audienceL'étude de l'évolution et de l'organisation de populations de cellules cultivées in vitro intéresse les biologistes depuis plusieurs dizaines d'années. À ces fins, d'importants progrès ont été réalisés dans les méthodes d'imagerie à l'échelle microscopique. Cependant, certaines informations demeurent inaccessibles, notamment à l'échelle mésoscopique, en raison du champ de vue réduit, ainsi que la complexité et le coût pour réaliser des acquisitions hors incubateur en temps réel sur de longues périodes. En réponse à ces limitations, nous avons développé la vidéo-microscopie sans lentille, en plaçant directement les cellules vivantes sur un capteur numérique en regard d'une illumination cohérente selon le principe de l'holographie en ligne. Cette technique permet l'observation d'une culture cellulaire sur un large champ de vue (24 mm² soit plusieurs dizaines de milliers de cellules), et ce à l'intérieur même de l'incubateur, autorisant de surcroît des acquisitions dynamiques couvrant des périodes allant de quelques jours à plusieurs semaines. À partir des images holographiques brutes acquises, nous pouvons remonter aux images refocalisées par reconstruction numérique jusqu'à une résolution de 2µm. Le traitement de ces images donne accès à des niveaux d'information quantifiables allant de la cellule unique à l'organisation inter-individus de la population. Avec des premières études sur des cultures standard de cellules sur substrat 2D, nous sommes aujourd'hui en mesure, avec notre dispositif et la force de l'imagerie holographique, d'explorer et d'étudier la vie cellulaire en 3D, nous rapprochant un peu plus de la réalité physiologique des phénomènes biologiques

STUDIO IN VITRO E IN VIVO DI SISTEMI TERMOSENSIBILI GELIFICANTI IN SITU CONTENENTI NANOPARTICELLE MEDICATE PER LA SOMMINISTRAZIONE TRANSCORNEALE DI 5-FLUOROURACILE.

Scopo del lavoro: Valutare la capacità di sistemi gelificanti in situ contenenti nanoparticelle (NP) medicate con 5-Fluorouracile (5-FU) di promuovere l’assorbimento transcorneale di 5-FU . Metodi: Sono stati preparati idrogeli termosensibili a base di chitosano a basso PM e suoi derivati caratterizzati da piccole catene laterali formate da gruppi ammonici quaternari adiacenti (sigla, N+Ch). Successivamente, su tali derivati sono stati introdotti gruppi tiolici (sigla, N+Ch-SH) mediante la formazione di legami ammidici con acido tioglicolico. Gli idrogeli sono stati ottenuti preparando soluzioni di chitosano e soluzioni di chitosano in cui percentuali predefinite di chitosano venivano sostituite con uguali percentuali dei derivati N+Ch oppure di N+Ch-SH. Queste soluzioni venivano raffreddate a 4°C e veniva aggiunta una soluzione di β-glicerofosfato disodico (β-GP) in acqua deionizzata, goccia a goccia. NP a base di chitosano e medicate con 5-FU sono state preparate mediante reticolazione ionotropica con acido ialuronico depolimerizzato (rHA), aggiungendo sotto agitazione un volume misurato di soluzione acquosa di rHA e 5-FU, a concentrazioni prestabilite, a 5 mL di soluzione di chitosano (0.25 mg/mL), in acqua deionizzata. Le NP sono state caratterizzate per dimensioni ed efficienza di intrappolamento. Per ottenere formulazioni stabili e manipolabili, le dispersioni nanoparticellari sono state liofilizzate. Le dispersioni nanoparticellari liofilizzate e protette mediante l’aggiunta di trealosio 5% (w/v) sono state ridisperse nelle soluzioni di chitosano o di chitosano e derivati a 4°C a cui era già stato aggiunto di β-GP. E’ stata verificata la conservazione delle dimensioni iniziali di nanoparticelle rese fluorescenti dopo ridispersione nelle soluzioni gelificanti con un microscopio confocale a scansione laser. Per le prove in vivo sull’occhio del coniglio è stato selezionata la soluzione gelificante che aveva le migliori caratteristiche tecnologiche e che riusciva a controllare meglio il rilascio di 5-FU. Per confronto abbiamo utilizzato una soluzione in tampone fosfato di 5-FU e al fine di valutare l’effetto della presenza delle NP nell’idrogel sull’assorbimento transcorneale di 5-FU sono state provate la soluzione gelificanti contenente o non le NP. Risultati: Gli idrogeli ottenuti a partire da soluzioni di chitosano a basso PM e suoi derivati N+Ch e N+Ch-SH contenenti NP medicate, gelificavano nell’intervallo di temperatura 30-35°C. La gelificazione degli idrogeli avveniva solo in particolari condizioni e dipendeva dal pH della soluzione dopo aggiunta di β-GP: quando si otteneva una efficace gelificazione, tale pH era circa 7. Le dimensioni medie delle NP determinate immediatamente dopo la loro preparazione e dopo ridispersione dei loro liofilizzati erano sempre comprese nell’intervallo 290-350 nm. Le immagini ottenute con il microscopio confocale a scansione laser mostravano che la ridispersione delle NP liofilizzate nelle soluzioni gelificanti dava luogo alla generazione di particelle di dimensioni inferiori a 450 nm. Le dimensioni delle NP non cambiavano in seguito a transizioni sol/gel. Il rilascio del farmaco dagli idrogeli contenenti NP medicate era più lento nel caso in cui la percentuale di sostituzione dei derivati N+Ch era maggiore. Per le prove in vivo è stata selezionata la formulazione a base di N+Ch che aveva mostrato un miglior profilo di rilascio di 5-FU rispetto alle altre. Le prove in vivo sono attualmente in corso. Il Draize test ha mostrato che le soluzioni gelificanti in situ sono ben tollerate e non provocano effetti tossici sull’occhio del coniglio quali iperemia, edema congiuntivale e lacrimazione. Conclusioni: sistemi gelificanti in situ ottenuti a partire da chitosano e suoi derivati contenenti NP medicate con 5-FU possono essere considerati un valido veicolo per la somministrazione transcorneale di 5-FU

Reflectance confocal microscopy for the diagnosis of skin infections and infestations

Reflectance confocal microscopy (RCM) is a noninvasive real-time imaging technique that has been widely used for the diagnosis of skin cancer. More recently, it has been reported as a useful tool for the diagnosis and management of several inflammatory and infectious skin disorders. This article provides an overview of the current available applications of RCM use in cutaneous infections and infestations. PubMed was used to search the following terms in various combinations: reflectance confocal microscopy, skin, hair, nail, infection, parasitosis, mycosis, virus, bacteria. All papers were accordingly reviewed. In most cutaneous infections or infestations, the main alterations are found in the epidermis and upper dermis, where the accuracy of confocal microscopy is nearly similar to that of histopathology. The high resolution of this technique allows the visualization of most skin parasites, fungi, and a few bacteria. Although viruses cannot be identified because of their small size, viral cytopathic effects can be observed on keratinocytes. In addition, RCM can be used to monitor the response to treatment, thereby reducing unnecessary treatments

EFFETTI DELLA TERAPIA CON METOPROLOLO E SFINGOSINA 1 FOSFATO IN UN MODELLO SPERIMENTALE DI SCOMPENSO CARDIACO POST-ISCHEMICO

Un evento patologico chiave nello Scompenso Cardiaco (SC) è la disregolazione dei recettori β adrenergici cardiaci (βAR) conseguenza dell’iperattivazione da parte delle catecolammine. I beta bloccanti hanno effetti terapeutici nei pazienti con SC in quanto impediscono l’ulteriore down-regulation recettoriale. Sono comunque necessari ulteriori studi per approfondire al meglio i meccanismi d’azione di questa classe di farmaci. Inoltre è stato dimostrato che in corso di SC si assiste alla disregolazione del sistema recettoriale della sfingosina1fosfato (S1P), un fosfolipide bioattivo con effetti cardioprotettivi, nonostante i livelli circolanti di tale fosfolipide siano ridotti. È noto che in corso di scompenso, l’iperattivazione dei recettori β adrenergici cardiaci, da parte delle catecolammine, porta anche ad una downregulation del recettore di tipo 1 della S1P, favorendo la progressione della patologia. Il cross-talk tra questi due sistemi recettoriali sembra essere orchestrato da GRK2, che rappresenta il principale regolatore di questa interazione. Nel presente studio abbiamo osservato che il Metoprololo, β bloccante selettivo per il recettore β1, è in grado di prevenire la disfunzione del signaling della S1P rallentando la progressione dello scompenso cardiaco. Quindi è possibile ipotizzare che parte degli effetti benefici mediati dai beta bloccanti siano dovuti al miglioramento del signaling della S1P

Geometria e costruzione. La teoria delle linee di curvatura nella stereotomia della pietra

Il contributo illustra lo studio teorico e pratico della teoria delle linee di curvatura delle superfici elaborata da Gaspard Monge alla fine del Settecento, e la sua applicazione alle costruzioni in pietra da taglio, con particolare riferimento al caso di studio (proposto da Monge e rivisitato da Hachette e Leroy) di una volta ellissoidale. L’intento è quello di ottimizzare la costruzione di queste linee nel metodo della rappresentazione matematica, almeno per il caso specifico di studio. Il legame che sussiste fra la le teorie geometrico descrittive e i principi della progettazione stereotomica è significativo. Costruzioni geometriche teoriche, apparentemente astratte, trovano riscontri e applicazioni nella pratica delle costruzioni e diventano, a volte, condizione indispensabile alla soluzione di casi complessi come quello presentato

Microscopie à deux photons pour l’imagerie cellulaire fonctionnelle : avantages et enjeux. ou Un photon c’est bien… mais deux c’est mieux !

L’observation de la dynamique des événements moléculaires dans la cellule in situ présente une série de défis, notamment la capacité de suivre ces événements avec le maximum de résolution spatiale et temporelle tout en minimisant l’interférence avec la biologie du tissu et de la cellule. L’exploitation récente d’approches fondées sur l’optique non-linéaire, telle que la microscopie par balayage laser de fluorescence produite par excitation à deux photons, a permis de faire des progrès énormes dans ce domaine, notamment parce qu’elle permet de faire des mesures dans un espace très confiné à l’intérieur du tissu intact et à des profondeurs inaccessibles avec la microscopie linéaire conventionnelle. En minimisant l’excitation indésirable du tissu en dehors du point focal, on améliore la résolution et la sensibilité, on simplifie le système optique et on minimise la phototoxicité. Ces avantages sont à la source du succès de la microscopie à deux photons pour l’imagerie cellulaire fonctionnelle. Des percées récentes en optique/photonique permettent d’envisager d’améliorer davantage la résolution spatiale et temporelle de ce type d’imagerie et la capacité de sonder encore plus profondément dans le tissu pour repousser les limites de la biochimie fonctionnelle et de la biologie cellulaire actuelles.One of the main challenges of modern biochemistry and cell biology is to be able to observe molecular dynamics in their functional context, i.e. in live cells in situ. Thus, being able to track ongoing molecular events with maximal spatial and temporal resolution (within subcellular compartments), while minimizing interference with tissue biology, is key to future developments for in situ imaging. The recent use of non-linear optics approaches in tissue microscopy, made possible in large part by the availability of femtosecond pulse lasers, has allowed major advances on this front that would not have been possible with conventional linear microscopy techniques. Of these approaches, the one that has generated most advances to date is two-photon laser scanning fluorescence microscopy. While this approach does not really provide improved resolution over linear microscopy in non absorbing media, it allows us to exploit a window of low absorbance in live tissue in the near infrared range. The end result is much improved tissue penetration, minimizing unwanted excitation outside the focal area, which yields an effective improvement in resolution and sensitivity. The optical system is also simplified and, more importantly, phototoxicity is reduced. These advantages are at the source of the success of two-photon microscopy for functional cellular imaging in situ. Yet, we still face further challenges, reaching the limits of resolution that conventional optics can offer. Here we review some recent advances in optics/photonics approaches that hold promises to improve our ability to probe the tissue in finer areas, at faster speed, and deeper into the tissue. These include super-resolution techniques, introduction of non paraxial optics in microscopy and use of amplified femtosecond lasers, yielding enhanced spatial and temporal resolution as well as tissue penetration