The use and development of computational docking: from cytochrome inhibitors to viral ion channel blockers

A dokkolás egy olyan számítógépes eljárás, amely során a ligandumot a célpontján található kötőzsebre helyezi a program és kötési affinitást számol közben. A receptor-ligandum komplex előállítása során a ligandum konformációs mintavételezése és a pozíciók energiaszámítása párhuzamosan történik. A módszerfejlesztési tanulmányok az említett folyamatok problémáinak azonosítására és megoldására törekszenek. A számítógépes dokkolás ismert nehézségei közé tartoznak a következők: a kiindulási (kísérletes) szerkezetek hibái, a receptor és a ligandum flexibilitása és mérete, a vízmolekulák megfelelő figyelembevétele, valamint a kísérletes adatok korrekt felhasználása, mint például a parciális töltéseké. Ezekkel a problémákkal foglalkozunk a disszertáció alapjául szolgáló közleményekben. Az I. közleményben a metabolikus enzimek ligandum kötését vizsgáltuk. A CYP enzimcsalád fehérjéiben megtalálható központi hem vas ionjának a parciális töltésére fektettünk külön hangsúlyt. A kísérletes szerkezetben a ketokonazol imidazol nitrogénje 2.7 Å távolságra helyezkedett el a hem gyűrű Fe3+ ionjától, ahhoz, hogy ezt a kötődést dokkolással reprodukálni tudjuk elengedhetetlen volt egy gáz fázisú kvantum mechanikai számítással előállított paraméter szett, amely figyelembe vette a katalitikus ciklus különböző töltési állapotait. Az értekezés alapjául szóló II. közleményben pedig az interfész vízmolekulák dokkolás során történő figyelembevételével foglalkozik. Ebben mind a kísérleti vízpozíciók kijavítása, mind az explicit parciális töltés asszignációja elengedhetetlennek bizonyult a kísérletes ligandum pozícióval való egyezéshez. Az influenza A és a SARS-CoV-2 vírusok transzmembrán ioncsatornái segítségével vizsgáltuk a vízmolekulák gyógyszerkötődésben játszott energetikai valamint szerkezeti szerepét illetve a gyógyszer repozícióra való hatásukat. Érdekes módon virális ioncsatornák esetében a vízmolekulák legalább olyan fontosnak bizonyultak a gyógyszerek kötődésében, mint maguk a fehérje célpontok. Mindkét tanulmányban elsődleges szempontként vettük figyelembe, hogy biológiailag fontos, különböző betegségek kialakulásában meghatározó szerepet játszó rendszereken hajtsuk végre és teszteljük a módszereinket, ezeket a következő fejezetekben mutatjuk be. PhD munkám során a célpont-ligandum komplexek számítására szolgáló számítógépes dokkolási eljárás alkalmazását és továbbfejlesztését tűztem ki célul. A számítógépes dokkolás jelenlegi formájában történő alkalmazhatóságát a CYP3A4 jelű, metabolizmusban kulcsszerepet játszó citokrómhoz, mint célponthoz történő ligandum kötődések esetében vizsgáljuk és egy már ismert szerkezetű és hatású ligandumot alapul véve

Prerequisite Binding Modes Determine the Dynamics of Action of Covalent Agonists of Ion Channel TRPA1

Transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) is a transmembrane protein channeling the influx of calcium ions. As a polymodal nocisensor, TRPA1 can be activated by thermal, mechanical stimuli and a wide range of chemically damaging molecules including small volatile environmental toxicants and endogenous algogenic lipids. After activation by such compounds, the ion channel opens up, its central pore widens allowing calcium influx into the cytosol inducing signal transduction pathways. Afterwards, the calcium influx desensitizes irritant evoked responses and results in an inactive state of the ion channel. Recent experimental determination of structures of apo and holo forms of TRPA1 opened the way towards the design of new agonists, which can activate the ion channel. The present study is aimed at the elucidation of binding dynamics of agonists using experimental structures of TRPA1-agonist complexes at the atomic level applying molecular docking and dynamics methods accounting for covalent and non-covalent interactions. Following a test of docking methods focused on the final, holo structures, prerequisite binding modes were detected involving the apo forms. It was shown how reversible interactions with prerequisite binding sites contribute to structural changes of TRPA1 leading to covalent bonding of agonists. The proposed dynamics of action allowed a mechanism-based forecast of new, druggable binding sites of potent agonists

Exploration of Somatostatin Binding Mechanism to Somatostatin Receptor Subtype 4

Somatostatin (also named as growth hormone-inhibiting -hormone or somatotropin release inhibiting factor) is a regulatory peptide important for the proper functioning of the endocrine system, local inflammatory reactions, mood and motor coordination, and behavioral responses to stress. Somatostatin exerts its effects via binding to G-protein-coupled somatostatin receptors of which the fourth subtype (SSTR4) is a particularly important receptor mediating analgesic, anti-inflammatory, and anti-depressant effects without endocrine actions. Thus, SSTR4 agonists are promising drug candidates. Although the knowledge of the atomic resolution-binding modes of SST would be essential for drug development, experimental elucidation of the structures of SSTR4 and its complexes is still awaiting. In the present study, structures of the somatostatin–SSTR4 complex were produced using an unbiased, blind docking approach. Beyond the static structures, the binding mechanism of SST was also elucidated in the explicit water molecular dynamics (MD) calculations, and key binding modes (external, intermediate, and internal) were distinguished. The most important residues on both receptor and SST sides were identified. An energetic comparison of SST binding to SSTR4 and 2 offered a residue-level explanation of receptor subtype selectivity. The calculated structures show good agreement with available experimental results and indicate that somatostatin binding is realized via prerequisite binding modes and an induced fit mechanism. The identified binding modes and the corresponding key residues provide useful information for future drug design targeting SSTR4

Synthesis of Spin-Labelled Bergamottin: A Potent CYP3A4 Inhibitor with Antiproliferative Activity

Bergamottin (BM, 1), a component of grapefruit juice, acts as an inhibitor of some isoforms of the cytochrome P450 (CYP) enzyme, particularly CYP3A4. Herein, a new bergamottin containing a nitroxide moiety (SL-bergamottin, SL-BM, 10) was synthesized; chemically characterized, evaluated as a potential inhibitor of the CYP2C19, CYP3A4, and CYP2C9 enzymes; and compared to BM and known inhibitors such as ketoconazole (KET) (3A4), warfarin (WAR) (2C9), and ticlopidine (TIC) (2C19). The antitumor activity of the new SL-bergamottin was also investigated. Among the compounds studied, BM showed the strongest inhibition of the CYP2C9 and 2C19 enzymes. SL-BM is a more potent inhibitor of CYP3A4 than the parent compound; this finding was also supported by docking studies, suggesting that the binding positions of BM and SL-BM to the active site of CYP3A4 are very similar, but that SL-BM had a better ∆Gbind value than that of BM. The nitroxide moiety markedly increased the antitumor activity of BM toward HeLa cells and marginally increased its toxicity toward a normal cell line. In conclusion, modification of the geranyl sidechain of BM can result in new CYP3A4 enzyme inhibitors with strong antitumor effects

Elucidation of the binding mode of organic polysulfides on the human TRPA1 receptor

Introduction: Previous studies have established that endogenous inorganic polysulfides have significant biological actions activating the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) receptor. Organic polysulfides exert similar effects, but they are much more stable molecules, therefore these compounds are more suitable as drugs. In this study, we aimed to better understand the mechanism of action of organic polysulfides by identification of their binding site on the TRPA1 receptor.Methods: Polysulfides can readily interact with the thiol side chain of the cysteine residues of the protein. To investigate their role in the TRPA1 activation, we replaced several cysteine residues by alanine via site-directed mutagenesis. We searched for TRPA1 mutant variants with decreased or lost activating effect of the polysulfides, but with other functions remaining intact (such as the effects of non-electrophilic agonists and antagonists). The binding properties of the mutant receptors were analyzed by in silico molecular docking. Functional changes were tested by in vitro methods: calcium sensitive fluorescent flow cytometry, whole-cell patch-clamp and radioactive calcium-45 liquid scintillation counting.Results: The cysteines forming the conventional binding site of electrophilic agonists, namely C621, C641 and C665 also bind the organic polysulfides, with the key role of C621. However, only their combined mutation abolished completely the organic polysulfide-induced activation of the receptor.Discussion: Since previous papers provided evidence that organic polysulfides exert analgesic and anti-inflammatory actions in different in vivo animal models, we anticipate that the development of TRPA1-targeted, organic polysulfide-based drugs will be promoted by this identification of the binding site