Charakterisierung von MUC16 (CA125) Knockdown Varianten einer humanen Ovarialkarzinomzellinie

Das tumorassoziierte Antigen CA125 (MUC16) wird häufig von Ovarialkarzinomen aber auch anderen epithelialen Tumoren überexprimiert. Obwohl CA125 Serumspiegel häufig zur Verlaufskontrolle von Ovarialkarzinompatientinnen angewendet werden, ist die physi-ologische Funktion dieses Muzins weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher den Einfluss eines MUC16 Knockdowns auf das Wachstum von Ovarialkarzinomzellen zu untersuchen. Nach transienter und stabiler Transfektion der Ovarialkarzinomzelllinie OAW-42H8+ mit MUC16 short hairpin RNA (shRNA) wurden daher Proliferation, Zellzyklus und Apoptoseraten in diesen Zellen analysiert. Daneben wurden zudem Veränderungen hinsichtlich Zelladhäsion, Migration und Invasion in stabilen MUC16 Knockdown Klonen untersucht. Nach transienter Transfektion von OAW-42H8+ mit MUC16 shRNA kam es zu einer sig-nifikante Hemmung des Wachstums durch Induktion einer caspasenabhängigen Apoptose. Dabei konnte eine Aktivierung von Caspase 3 sowie eine vermehrte Spaltung von PARP nachgewiesen werden. Wachstumshemmung und vermehrte Apoptoseraten wurden in stabilen MUC16 Knockdown Klonen so bestätigt. Allerdings zeigte sich hier keine Akti-vierung caspasenabhängiger Signaltransduktionswege mehr. Weder eine signifikante Akti-vierung der Caspase 3 noch eine Spaltung von PARP waren im stabilen MUC16 Knock-down Klon nachweisbar. Die Zellen wurden daher hinsichtlich einer mitochondrialen Frei-setzung von caspasenunabhängigen Faktoren untersucht. In der Tat konnte in stabilen MUC16 Knockdown Klonen eine Translokation von AIF aus dem Mitochondrium in den Zellkern nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse aus transienten und stabilen MUC16 Knockdown Versuchen einen Wechsel von caspasenabhängiger Apoptose hin zu einem caspasenunabhängigem Zelltod nach Langzeitkultivierung des stabilen MUC16 Knockdown Klons der Ovarialkarzinomzelllinie OAW-42H8+. Weiterhin zeigte sich neben einer Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion auch eine signifi-kant verminderte Klonogenität nach stabilem MUC16 Knockdown. Da der PI3K/AKT Signalweg in Ovarialkarzinomzellen häufig aktiviert ist und an multiplen zellulären Funk-tionen wie Wachstum, Zellzykluskontrolle und Apoptose beteiligt ist wurde daraufhin der Einfluss von MUC16 auf diesen Signalweg weiter untersucht. Sowohl die Aktivierung von AKT als auch die Expression von AKT waren im stabilen MUC16 Knockdown Klon un-terdrückt. Weiterhin wurden nachgeschaltete Effektormoleküle von AKT wie 4EBP1 und S6, die an der Regulation von Translation und Zellwachstum beteiligt sind, gehemmt. Die verminderte Aktivierung von AKT war zudem mit einer Hemmung des anti-apoptotisch wirksamen Bcl-2 im stabilen MUC16 Knockdown Klon verbunden. Damit beeinflusst MUC16 damit das Zellwachstum in Ovarialkarzinomen durch Interaktion mit dem PI3K/AKT Signalweg, wobei auch andere Signalwege an dieser Regulation beteiligt sein können. Im Gegensatz dazu hatte MUC16 keinen Einfluss auf Migration und Invasion der OAW-42H8+ Zelllinie. Allerdings weist diese Zelllinie generell einen eher unbeweglichen und nichtinvasiven Phänotyp auf, sodass Unterschiede durch MUC16 Knockdown nicht nachweisbar waren. Zusammenfassend nimmt MUC16 eine zentrale Rolle am Überleben von Ovarialkarzi-nomzellen ein. Dabei werden sowohl verschiedene Apoptosesignalwege als auch der PI3K/AKT Signalweg beeinflusst. MUC16 ist damit ein idealer Angriffspunkt für eine zielgerichtete Krebstherapie. Zur Etablierung weiterer Therapieoptionen bedarf es jedoch einer steten Erweiterung des Verständnisses zur physiologischen Funktion und insbesonde-re Interaktion von MUC16 mit den verschiedenen Signalwegen in Ovarialkarzinomen in vitro und in vivo

Untersuchung inflammatorischer Immunzellsubsets im Aszites von Ovarialkarzinom Patientinnen

Das Ovarialkarzinom entwickelt sich lange unbemerkt und wird meist erst in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, in dem bereits Peritonealmetastasen und maligner Aszites auftreten. Welche Mechanismen dazu führen, dass in der Pathogenese zwar eine tumorassoziierte Inflammation, aber keine effektive Immunantwort entsteht, ist bislang noch nicht völlig geklärt. Insbesondere die protumoröse sowie antitumoröse Wirkung inflammatorischer Immunzellsubsets wird in diesem Zusammenhang kontrovers diskutiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion von TAMs, TH17-Zellen, Effektor-T-Zellen und Tregs bei 20 Patientinnen mit high-grade serösem Ovarialkarzinom zu untersuchen und deren Auswirkung auf das progressionsfreie Überleben zu evaluieren. Die Konzentrationen der TAM- und T-Zellsubsets wurden über verschiedene Oberflächenmarker sowie ausgewählter, intrazellulärer Marker wie Zytokine (insbesondere IL-17 und IFNg) im Aszites und zum Vergleich im peripheren Blut bestimmt. In Funktionsassays wurden die Prolifertionskapazität von Effektor T-Zellen und die Suppression durch Tregs bestimmt. Da bereits im Vorfeld gezeigt werden konnte, dass das Vorkommen von CD163low TAMs im Aszites mit einer schlechten Prognose assoziiert ist, erfolgte zusätzlich eine Subgruppenanalyse der T-Zellsubsets in Patienten mit CD163low und CD163high TAMs. Die Ergebnisse wurden statistisch analysiert und auf signifikante Korrelationen untersucht. Suppressive und aktivierende Mechanismen sollten somit aufgedeckt werden, um daraus Rückschlüsse hinsichtlich der Tumorentwicklung ziehen zu können. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass TH17-Zellen positiv mit der CD163 Expression auf TAMs im Aszites assoziiert sind. Aszitesproben mit prädominanten CD163low TAMs enthielten dementsprechend deutlich weniger TH17-Zellen als das periphere Blut. Auch die Zahl der CD4+ T-Helfer Zellen war im Aszites reduziert. Dagegen war die Proliferationsfähigkeit und IFNg Expression als Zeichen der antitumorösen Immunantwort bei CD4+ Effektor-T-Zellen im Aszites erhöht. Die IFNg Expression korrelierte signifikant mit der Frequenz der TH17-Zellen. Im CD163low Subset war diese Assoziation besonders stark. Im CD163high Subset war die IFNg Expression negativ zur CD163 und CD206 Expression auf TAMs assoziiert. Tregs supprimierten signifikant Effektor T-Zellen, aber nicht TH17-Zellen. Aszitesproben mit einer hohen TH17-Zell Frequenz korrelierten tendenziell positiv mit dem progressionsfreien Überleben. Allgemein gehen hohe Level von CD163 auf TAMs mit einer schlechten Prognose einher. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass über CD163 und CD206 die Effektor-T-Zellantwort inhibiert wird. Unsere Ergebnisse zeigen darüber hinaus eine positive Assoziation zwischen CD163 und den TH17-Zellen. Andererseits scheinen TH17-Zellen die IFNg Expression in Effektor-T-Zellen zu induzieren und somit vor allem antitumorös zu wirken. Tendenziell besteht zudem bei Patientinnen mit hohen TH17-Zell Konzentrationen im Aszites ein verbessertes progressionsfreies Überleben. Sie scheinen insgesamt also eher antitumorigen zu wirken. Wahrscheinlich eignen sich TH17-Zellen nicht allein als prognostischer Marker, aber unter Umständen in Kombination mit anderen Immunzellsubsets oder löslichen Mediatoren im Aszites. Mögliche Zusammenhänge zwischen dem TAM-Polarisiergunszustand und unterschiedlichen T-Zellsubpopulationen sollten in funktionalen Assays untersucht werden und könnten Grundlagen für die Entwicklung von neuen Diagnostik- und Therapiemöglichkeiten beim Ovarialkarzinom liefern