Exploring MEK5/ERK5 signaling and miRNAs as therapeutic strategies in colon cancer

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011O cancro e, actualmente, a segunda causa de morte no mundo ocidental, sendo o cancro colorectal, a terceira forma de cancro mais commumente diagnosticada, tanto no homem, como na mulher. Mais ainda, o cancro colorectal e a terceiraprincipal causa de morte relacionada com o cancro.A transformacao do tecido colonico normal e o desenvolvimento do cancro colorectal e considerado um processo faseado, com acumulacao de diferentes alteracoes geneticas e epigeneticas, que levam a transformacao do epitelio normal em adenoma e, mais tarde, em carcinoma. Adenomas ou polipos sao neoplasmas que, embora apresentem vantagem proliferativa inerente e reducao de diferenciacao, progridem para formas malignas em apenas 10% dos casos. Um dos principais eventos moleculares que pode conduzir ao desenvolvimento e progressao do cancro e a perda de estabilidade genomica que, no caso do cancro colorectal, esta associada a instabilidade de microssatelites e a instabilidade cromossomica. A instabilidade de microssatelites e caracterizada pela presenca de mutações em genes do sistema de reparacao de mismatchesno DNA, as quais podem resultar na inserção ou deleccao de repeticoes em microssatelites. Os microssatelites, por sua vez, sao pequenas repeticoes de sequencias de nucleotidos, contendo cerca de uma duzia de repeticoes de 4 a 6 sequencias nucleotidicas. As mutacoes geradas em cancros com instabilidade de microssatelites sao, inicialmente, aleatorias, afectando qualquer repeticao de microssatelite. Alguns clones podem, no entanto, adquirir mutacoes em genes chave, conferindo a celulavantagem proliferativa. A instabilidade cromossomica e o tipo de instabilidade genómica mais comum, ocorrendo em cerca de 80 a 85% dos tumores colorectais esporadicos, que não apresentam deficiencias no sistema de reparacao de mismatches noDNA. Tumores com instabilidade cromossomica estao associados a uma elevada frequencia de aneuploidias e desequilibrios alelicos, apresentando em geral, um prognostico pior do que tumores com deficiencias no sistema de reparacao demismatchesnoDNA. Nos neoplasmas colorectais e, ainda, comum a instabilidade epigenetica, a qual resulta da metilacao aberrante de genes supressores de tumores. Dentro dos tumores esporaricos com instabilidade de microssatelites, a instabilidade epigenetica manifesta-se atraves da metilacao do promotor de genes envolvidos na reparacao do DNA, nomeadamente do gene MLH1. Varias vias de sinalizacao que regulam o ciclo celular e a apoptose encontram-se desreguladas na transformacao, desenvolvimento e progressao tumoral, levando a um aumento descontrolado da proliferacao celular e a quase completa insensibilidade a estímulos pro-apoptoticos. Destacam-se a sobreactivacao das vias de sinalizacao das MAPKs, do NF-B e do PI3/AKT, que promovem a proliferacao celular, bem como a mutacao do p53, que inibe a apoptose numa elevada percentagem de carcinomas. A desregulacao da expressao de microRNAs (miRNAs) tem sido associada ao desenvolvimento de varios tipos de cancro, incluindo o cancro colorectal, atraves da alteração dos niveis de producao dos varios mediadores envolvidos nestas vias de sinalizacao celular. Os miRNAs sao pequenas moleculas de RNA nao codificante que regulam negativamente a expressao genica, a nivel pos-transcricional, atraves da repressao da traducao do mRNA alvo, ou da clivagem e degradacao do mesmo, estando este processo dependente do grau de complementaridade entre o miRNA maduro e o mRNA alvo. A accao dos miRNAs esta envolvida na regulacao de inumeros processos biologicos, nomeadamente na proliferação celular e na apoptose. Curiosamente, observou-se que o miRNA-143 (miR-143) apresenta expressao reduzida no cancro colorectal, assim como em outros tipos de cancro, sendo que um dos seus principais alvos biologicos e a ERK5. A accao do miR-143 na inibicao do crescimento tumoral, com modulacao da expressao de ERK5, foi ja demonstrada pelo nosso grupo, tanto in vitro, como in vivo. Nao existe, actualmente, qualquer informacao disponivel na literatura relativa a producao da proteina ERK5, ou da sua proteina activadora directa, a MEK5, no cancro colorectal. No entanto, o aumentonos niveis destas duas cinases foi ja observado em outros tipos de cancro, estando associado ao aumento de proliferacao, progressao tumoral e resistencia a terapeutica,para alem de se correlacionar com um pior prognostico da doenca. Um dos objectivos do presente trabalho foi analisar a producaodas proteina ERK5 e MEK5 durante o desenvolvimento e progressao do cancro colorectal, por forma a determinar se esta via de sinalizacao pode constituir um novo alvo terapeutico no cancro colorectal. Foi estudado um conjunto bem definido de 197 amostras humanas, incluindo tecido normal, adenomas e carcinomas, com e sem instabilidade de microsatelites. Os resultados demonstram, inequivocamente, que as cinases ERK5 e MEK5 se encontram aumentadas no cancro colorectal e que, possivelmente, a sinalizacao via ERK5 e um evento importante na iniciacao da transformacao tumoral. De facto, verificou-se um aumento significativo de ERK5 e MEK5 em adenomas, bem como em carcinomas, de forma independente da integridade do sistema de reparacao de mismatchesno DNA, relativamente ao tecido colonico normal. Sugere-se, assim, que a ERK5 podera representar um alvo terapeutico novo e relevante no cancro colorectal, possivelmente atraves da reducao da sua producao induzida pelo miR-143. O estudo de mediadores de outras vias de sinalizacao, importantes no desenvolvimento tumoral, como o NF-B e o AKT, revelou que estao alteradosdurante o desenvolvimento do cancro colorectal, tanto nos polipos, como nos carcinomas com e sem instabilidade de microsatelites. Confirmou-se, ainda, que a perda de funcao da proteina p53 esta envolvida na transicao de adenoma para carcinoma e que a frequencia de ocorrencia de mutacoes no p53 esta relacionada com a funcionalidade do sistema de reparacao de mismatches no DNA. Tendo em conta o conhecimento actual do potencial anti-proliferativo, pro-apoptotico e quimiosensibilizador do miR-143, possivelmente atraves da repressao da via de sinalização da ERK5, outro objectivo do presente trabalho consistiu no desenvolvimento de uma estrategia eficiente de entrega do miR-143, tendo em vista o seu uso como ferramenta terapeutica no tratamento do cancro colorectal. O maior obstaculo na aplicacao terapêutica dos miRNAs esta relacionado com o seu direcionamento para as celulas alvoin vivo, bem como com a sua estabilidade, uma vez que os miRNAs, nao modificados e desprotegidos, são instaveis em circulacao. O sistema de entrega em desenvolvimento neste estudo baseia-se na conjugacao do miR-143 com o cetuximab, ja utilizado no cancro colorectal como terapia dirigida. O cetuximab e um anticorpo monoclonal que se liga ao receptor EGFR, frequentemente aumentado no cancro colorectal, promovendo a sua internalizacao e degradacao. O tratamento com este anticorpo melhora significativamente a sobrevivencia dos doentes e a progressao livre de doenca, sendo, no entanto, a sua eficacia dependenteda ausencia de mutacoes no KRAS. Sabendo que o miR-143 apresenta efectores especificos a jusante na via do EGFR, KRAS e ERK5, como principais alvos, o potencial terapeutico do miR-143 e elevado e poderá aumentar a eficacia do cetuximab. O objectivo ultimo e tirar partido da especificidade do cetuximab para direccionar o miR-143 para as celulas com producao aumentada de EGFR. A estrategia de entrega desenvolvida baseou-se na conjugacao do cetuximab com fluoresceína 5(6)-isotiocianato (FITC). De seguida, o anticorpo conjugado foi complexado com um anticorpo anti-FITC, conjugado com protamina (anti-FITC-protamina), numa proporção superior ao numero de moleculas de FITC conjugadas com o cetuximab, para garantir que todos os residuos de FITC no cetuximab estejam ocupados e, desta forma, maximizar a carga de miRNA em cada molecula de cetuximab. Por fim, o miR-143 sera marcado com o fluoróforo Cy3 e carregado nas protaminas. A protamina e uma proteina carregada positivamente, com afinidade para acidos nucleicos, que apresenta um grande potencial para a entrega de pequenos RNAs em celulas de cancro, ja demonstrado in vitro e in vivo. O progresso conseguido no desenvolvimento desta ferramenta permitiu demonstrar que o cetuximab conjugado com FITC manteve a capacidade de ligacao ao EGFR, para alem de que o complexo terapeutico constituido por cetuximab-FITC e anti-FITC-protamina foi entregue em celulas de cancro colorectal com niveis elevados de EGFR. Uma vez que a eficiencia desta ferramenta depende, em grande medida, da ligacao e internalizacao do complexo nas celulas alvo, os resultados obtidos ate agora reforcam o potencial desta estrategia de entrega, para alem de estimularem estudos futuros com vista a sua utilizacao terapeutica.Colorectal cancer (CRC) is a major health problem worldwide, with high incidence, representing a major cause of cancer related deaths. The development of CRC is considered a stepwise process, with the accumulation of genetic and epigenetic alterations, which contribute to transformation of normal colonic epithelium into adenoma, and eventually to carcinoma. The overexpression of ERK5 and MEK5 have been reported in many types of human cancer and correlated with increased cell survival, proliferation, chemoresistance and poor disease prognosis. Curiously, no information is available on ERK5 or MEK5 expression profiles in CRC. However, ERK5 expression is directly regulated by microRNA-143 (miR-143), typically downregulated in CRC. The aim of the present work was to evaluate the expression levels of ERK5 and MEK5 in normal colon, colon adenomas, and colon carcinomas. In addition, we aimed to develop an efficient delivery strategy for future use of miR-143 in CRC therapy, using cetuximab as a delivery vehicle. Our results provide the first human data demonstrating the aberrant overexpression of ERK5 and MEK5 in adenomas and, to a lesser extent, carcinomas. This suggests ERK5 as a potential target for the development of novel cancer therapies. Further, we confirmed a significant deregulation of NF-B and AKT signaling pathways, thought to be involved in cancer development and progression. p53, a key player in adenoma-carcinoma transition was also deregulated. Finally, we built an effective delivery complex, delivered to target cells with high affinity, highlighting the potential of this strategy for cancer cell delivery of miRNA therapeutics

Novel therapeutic targets in colon cancer

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016Colon cancer is a major health problem worldwide, representing the third most commonly diagnosed non-cutaneous cancer in men and the second most common in women. Interestingly, colon cancer-related deaths have decreased over the last decades. This is largely attributed to improvement in screening methods and shift in risk behavior. Only in 12% of the cases is mortality decline attributed to improved therapeutics. In addition, despite the accomplishments in colon cancer management, the metastatic form of the disease is the most commonly diagnosed and remains almost incurable. The implementation of new cytotoxic or targeted systemic agents, however, greatly improved current treatment options. Further, the belief is that the best therapeutic choice would be an appropriate combination therapy. Therefore, the discovery of new druggable targets is in high demand to improve colon cancer therapy, and multiple efforts have been undertaken to produce novel agents and to design novel combination therapies. The studies presented in this thesis were driven by the need to provide novel druggable targets, as well as suitable targeted delivery strategies for efficient and specific treatment of colon cancer. We explored the potential of cetuximab as a specific targeting agent to direct antibody-protamine conjugated and solid lipid nanoparticle systems, thoroughly designed to deliver microRNAs (miRNAs), to colon cancer cells. The results confirmed that cetuximab represents a successful specific targeting agent adequately supporting the development of the delivery tools. More importantly, our data demonstrated that the delivery systems are stable enough to reach target cells and be efficiently internalized. Further method development efforts resulted in a novel, simple and effective protocol that allows protein recovery from biological samples previously treated with TRIzolR and TRIzolRLS for RNA and/or DNA collection, thus surpassing the manufacturer’s limitations and improving extraction performance. In addition, this improvement greatly increases the amount of information extracted from a single sample. Finally, we hypothesized that ERK5 signaling represents a relevant protein and putative therapeutic target in colon cancer. ERK5 has recently been reported overexpressed in top-leading diagnosed cancers, and several lines of evidence suggest its potential deregulation in colon cancer. MiRNA-143, whose main target is ERK5 messenger RNA, is typically downregulated in colon cancer. Moreover, we have previously demonstrated that induced expression of miRNA-143, with concomitant repression of ERK5, contributes to reduced colon tumor growth and sensitization to 5-FU treatment. Remarkably, our results showed that ERK5 is aberrantly expressed in colon adenomas and adenocarcinomas, regardless of DNA mismatch repair system status, and that ERK5 overexpression correlates with more advanced and aggressive colon cancer. In addition, we demonstrated that ERK5 activation accelerates cell cycle progression and increases tumor cell migration via NF-κB activation, increasing its relevance as a potential druggable target. Further, in a mouse model, lymph node metastasis was exclusively seen in orthotopically implanted tumors with overactivated MEK5/ERK5 signaling, and not in tumors with inhibited MEK5/ERK5. In conclusion, the results presented in this thesis suggest two potential delivery strategies of small non-coding RNAs that are expected to unravel new therapeutic options for colon cancer; provide a protocol suitable for simultaneous isolation of proteins coupled to nucleic acid isolation; and unveil the role of ERK5 signaling as a novel relevant therapeutic target in colon cancer.O cancro do cólon representa um grave problema de saúde pública mundial, sendo o terceiro tipo de cancro mais diagnosticado no homem e o segundo mais diagnosticado na mulher. A incidência mundial do cancro do cólon parece ter estabilizado desde 2005, atingindo atualmente 1.400.000 novos casos por ano e conduzindo a aproximadamente 700.000 mortes por ano. Curiosamente, a incidência de cancro do cólon em indivíduos com mais de 50 anos tem vindo a diminuir. Por outro lado, esta mesma incidência tem crescido na população mais nova, com menos de 50 anos, provavelmente em virtude do aumento da incidência de obesidade e de dietas inapropriadas. Existe, no entanto, uma grande discrepância geográfica quanto a incidência do cancro cólon, com a maioria das novas ocorrências em países desenvolvidos. Por outro lado, a mortalidade associada ao cancro do cólon e consideravelmente superior nos países em vias de desenvolvimento, em parte devido a falta de apoios médicos, que permitam o diagnóstico atempado dos tumores e a falta de consciencialização da população sobre comportamentos de risco. Apesar do grande desenvolvimento farmacêutico e médico, apenas em 12% dos casos a redução da mortalidade associada ao cancro do cólon e atribuída ao desenvolvimento de novos medicamentos. No que respeita ao tratamento, o cancro do cólon evoluiu substancialmente com a utilização do agente quimioterapêutico 5-fluouracilo. No entanto, a forma metastática da doença, que corresponde a maioria dos casos diagnosticados, permanece ainda praticamente incurável. A descoberta de novos alvos terapêuticos e estratégias de tratamento e urgente e tem sido o principal foco da investigação em cancro do cólon. Ao longo dos anos, a implementação de novos agentes sistémicos para o cancro do cólon, incluindo moléculas citotóxicas, como a oxaliplatina, ou direcionadas, como o cetuximab, aumentaram consideravelmente as opções terapêuticas. No entanto, a taxa de sucesso destes agentes nunca atingiu o pretendido e a implementação de terapias combinadas tem despertado grande interesse. E neste contexto que os microRNAs (miRNAs) apresentam um enorme potencial de aplicação terapêutica, uma vez que tem a capacidade de modular diversos alvos em simultâneo e, dessa forma, influenciar várias vias de sinalização. No entanto, a eventual aplicação dos miRNAs na terapia está longe de se concretizar, em parte, por não existirem até a data veículos capazes de transportar estes agentes especificamente para as células alvo. Um dos objetivos do presente trabalho foi o desenvolvimento de uma potencial ferramenta para direcionar e entregar agentes terapêuticos, como os miRNAs. Explorou-se o papel do anticorpo monoclonal cetuximab como agente de direcionamento específico do sistema conjugado anticorpo-protamina e de nanopartículas lipídicas sólidas, capazes de carregar e entregar miRNAs. O desenvolvimento destes sistemas terapêuticos pretende combinar o efeito terapêutico do cetuximab com o potencial dos miRNAs, procurando assim uma abordagem de terapia combinada. O sistema conjugado anticorpo-protamina implica a conjugação do cetuximab com um anticorpo de fusão com protamina. A protamina, por sua vez, apresenta afinidade para ácidos nucleicos, sendo capaz de transportar os miRNAs ate as células. Por outro lado, o sistema de nanopartículas lipídicas sólidas implica a funcionalização da superfície das nanopartículas lipídicas com o cetuximab, bem como o transporte de miRNAs no seu interior. Os resultados obtidos demonstraram que o cetuximab e capaz de atuar com sucesso, como agente de direcionamento específico dos nossos complexos terapêuticos para as células alvo. Mais ainda, os complexos produzidos são estáveis e eficientemente internalizados nas células alvo. Estas duas plataformas poderão, de futuro, ser utilizadas com vista a uma aplicação terapêutica de miRNAs. No presente trabalho foi também desenvolvida uma metodologia que permite o isolamento de proteínas totais a partir de amostras previamente tratadas com TRIzolR ou TRIzolRLS para extração de ácidos nucleicos. A metodologia desenvolvida e nova, simples e mais eficiente, aumentando enormemente a quantidade de informação recolhida a partir de uma única amostra biológica e ultrapassando as limitações do protocolo original. Esta nova metodologia foi crucial nos estudos seguintes, de descoberta de melhores alvos terapêuticos no tratamento do cancro do cólon. Vários membros da família das cinases MAPK tem surgido como alvos terapêuticos interessantes. No entanto, ate a data, o único fármaco aprovado para o tratamento do cancro foi o Trametinib, um inibidor da via de sinalização ERK1/2, utilizado no melanoma metastático. Curiosamente, a relevância do papel da ERK5, o membro das MAPK descoberto mais recentemente, tem crescido exponencialmente. A expressão e/ou ativação da ERK5 já foi reportada como estando aumentada em diversos tipos de tumores, para alem de ter sido associada a um pior prognostico. No entanto, o papel da ERK5 no cancro do colon encontra-se ainda por desvendar, apesar de diversas evidências apontarem também para a sua desregulação neste tipo de tumor. De facto, o miRNA-143, cujo principal alvo e o RNA mensageiro da ERK5, encontra-se tipicamente reduzido em tumores de cancro do cólon. Para além disso, a indução da expressão de miRNA-143, com consequente redução dos níveis de ERK5, esta associada a um melhor prognóstico, verificando-se diminuição do crescimento tumoral e sensibilização ao tratamento. Surpreendentemente, os resultados demonstraram que a ERK5 se encontra sobreexpressa em adenomas e adenocarcinomas do colon e, mais ainda, que níveis elevados da expressão da ERK5 estão correlacionados com uma maior agressividade dos tumores. De facto, demonstramos que a ativação da via de sinalização da ERK5 acelera a progressão do ciclo celular e aumenta a migração de células tumorais do colon, por intermédio da ativação da via do NF-κB. Estes resultados corroboram a relevância da via da ERK5 como potencial alvo terapêutico no cancro do colon. Em suma, os estudos apresentados nesta tese propõem duas estratégias de entrega de agentes terapêuticos, que poderão proporcionar o desenvolvimento de novas opções de tratamento no cancro do cólon; permitem o estabelecimento de um protocolo otimizado de recolha simultânea de proteínas e ácidos nucleicos de amostras biológicas tratadas com TRIzolR ou TRIzolRLS; e, por fim, desvendam o potencial papel da via da ERK5 como novo alvo terapêutico no cancro do cólon