In silico identification and expression of SLC30 family genes: An expressed sequence tag data mining strategy for the characterization of zinc transporters' tissue expression

BACKGROUND: Intracellular zinc concentration and localization are strictly regulated by two main protein components, metallothioneins and membrane transporters. In mammalian cells, two membrane transporters family are involved in intracellular zinc homeostasis: the uptake transporters called SLC39 or Zip family and the efflux transporters called SLC30 or ZnT family. ZnT proteins are members of the cation diffusion facilitator (CDF) family of metal ion transporters. RESULTS: From genomic databanks analysis, we identified the full-length sequences of two novel SLC30 genes, SLC30A8 and SLC30A10, extending the SLC30 family to ten members. We used an expressed sequence tag (EST) data mining strategy to determine the pattern of ZnT genes expression in tissues. In silico results obtained for already studied ZnT sequences were compared to experimental data, previously published. We determined an overall good correlation with expression pattern obtained by RT-PCR or immunomethods, particularly for highly tissue specific genes. CONCLUSION: The method presented herein provides a useful tool to complete gene families from sequencing programs and to produce preliminary expression data to select the proper biological samples for laboratory experimentation

In vivo expression and functional characterization of the zinc transporter ZnT8 in glucose-induced insulin secretion.

International audienceInsulin-secreting pancreatic beta cells are exceptionally rich in zinc. In these cells, zinc is required for zinc-insulin crystallization within secretory vesicles. Secreted zinc has also been proposed to be a paracrine and autocrine modulator of glucagon and insulin secretion in pancreatic alpha and beta cells, respectively. However, little is known about the molecular mechanisms underlying zinc accumulation in insulin-containing vesicles. We previously identified a pancreas-specific zinc transporter, ZnT-8, which colocalized with insulin in cultured beta cells. In this paper we studied its localization in human pancreatic islet cells, and its effect on cellular zinc content and insulin secretion. In human pancreatic islet cells, ZnT-8 was exclusively expressed in insulin-producing beta cells, and colocalized with insulin in these cells. ZnT-8 overexpression stimulated zinc accumulation and increased total intracellular zinc in insulin-secreting INS-1E cells. Furthermore, ZnT-8-overexpressing cells display enhanced glucose-stimulated insulin secretion compared with control cells, only for a high glucose challenge, i.e. >10 mM glucose. Altogether, these data strongly suggest that the zinc transporter ZnT-8 is a key protein for both zinc accumulation and regulation of insulin secretion in pancreatic beta cells

Quantitative Proteomic Approach Reveals Altered Metabolic Pathways in Response to the Inhibition of Lysine Deacetylases in A549 Cells under Normoxia and Hypoxia.

Growing evidence is showing that acetylation plays an essential role in cancer, but studies on the impact of KDAC inhibition (KDACi) on the metabolic profile are still in their infancy. Here, we analyzed, by using an iTRAQ-based quantitative proteomics approach, the changes in the proteome of KRAS-mutated non-small cell lung cancer (NSCLC) A549 cells in response to trichostatin-A (TSA) and nicotinamide (NAM) under normoxia and hypoxia. Part of this response was further validated by molecular and biochemical analyses and correlated with the proliferation rates, apoptotic cell death, and activation of ROS scavenging mechanisms in opposition to the ROS production. Despite the differences among the KDAC inhibitors, up-regulation of glycolysis, TCA cycle, oxidative phosphorylation and fatty acid synthesis emerged as a common metabolic response underlying KDACi. We also observed that some of the KDACi effects at metabolic levels are enhanced under hypoxia. Furthermore, we used a drug repositioning machine learning approach to list candidate metabolic therapeutic agents for KRAS mutated NSCLC. Together, these results allow us to better understand the metabolic regulations underlying KDACi in NSCLC, taking into account the microenvironment of tumors related to hypoxia, and bring new insights for the future rational design of new therapies

In Vitro Dermal Safety Assessment of Silver Nanowires after Acute Exposure: Tissue vs. Cell Models

Silver nanowires (AgNW) are attractive materials that are anticipated to be incorporated into numerous consumer products such as textiles, touchscreen display, and medical devices that could be in direct contact with skin. There are very few studies on the cellular toxicity of AgNW and no studies that have specifically evaluated the potential toxicity from dermal exposure. To address this question, we investigated the dermal toxicity after acute exposure of polymer-coated AgNW with two sizes using two models, human primary keratinocytes and human reconstructed epidermis. In keratinocytes, AgNW are rapidly and massively internalized inside cells leading to dose-dependent cytotoxicity that was not due to Ag+ release. Analysing our data with different dose metrics, we propose that the number of NW is the most appropriate dose-metric for studies of AgNW toxicity. In reconstructed epidermis, the results of a standard in vitro skin irritation assay classified AgNW as non-irritant to skin and we found no evidence of penetration into the deeper layer of the epidermis. The findings show that healthy and intact epidermis provides an effective barrier for AgNW, although the study does not address potential transport through follicles or injured skin. The combined cell and tissue model approach used here is likely to provide an important methodology for assessing the risks for skin exposure to AgNW from consumer products

Utilisation des molécules anti-radicalaires en cosmétique

Le stress oxydant est défini comme l'effet délétère de molécule oxydantes ou radicalaires, en particulier les espèces réactives de l'oxygène, sur les molécules et macromolécules biologiques. Dans notre monde moderne, les sources de ce stress oxydant en pleines expansions et les mauvais comportements contribuent à son augmentation. La peau, première barrière contre ces agressions est donc la plus sensible à ces radicaux. Les établissements cosmétologiques ont donc supplémentés leurs produits en actifs antioxydants pour l'aider. Ces antioxydants nombreux et variés ont fait l'objet de notre étude qui a consisté à collecter des informations sur leur structure, leur activité antioxydante ou leur utilité en photoprotection. Ce travail met en évidence certaines difficultés concernant la collecte de données, notamment la nature et teneurs en anti-oxydants des produits cosmétiques. Notre conclusion soulève le problème d'une absence de standardisation des méthodes d'évaluation des activités antioxydantes et le manque d'études in vivo. Notre étude permet de dégager trois tendances dans le développement de produits cosmétiques à propriétés anti-radicalaires: l'association de plusieurs actifs, la recherche d'actifs inducteurs de systèmes enzymatiques et l'utilisation prépondérante d'actifs issus du monde végétal.GRENOBLE1-BU Médecine pharm. (385162101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Le secretome, un modèle adapté à l'étude des protéines sécrétées par les tumeurs (application à l'analyse du rôle joué par p53 sur la sécrétion de protéines par des celllules du cancer du poumon)

Le cancer est un véritable problème de santé publique et représentera en 2010 la première cause de mortalité dans le monde. La lutte contre cette maladie est donc, plus que jamais, un enjeu capital. Les processus tumoraux associés à la carcinogénèse, tels que la métastase, l'invasion ou l'angiogenèse, dépendent étroitement de la composition du milieu extracellulaire, lui-même affecté par la sécrétion de protéines par les cellules tumorales. La mutation ou la variation d'expression de facteurs pro- ou anti-oncogénique joue un rôle important dans le développement et la progression de la tumeur. Durant ce travail de thèse, nous avons voulu apporter des éléments de réponse à la problématique suivante : l'étude par protéomique des protéines sécrétées par la tumeur apporte t'elle des informations contribuant à la compréhension des mécanismes de la tumorogenèse et peut elle permettre de mettre en valeur de nouvelles cibles d'intérêt clinique ? Nous avons ciblé notre étude sur le cancer du poumon, le plus fréquent au niveau mondial tant en terme d'incidence que de mortalité. Ce cancer présente le plus fort taux de mutation du gène p53, un anti-oncogène clé de la cellule. Cette perte de fonction module la sécrétion de nombreuses protéines dont l'investigation est primordiale, bien que paradoxalement, peu étudiée. Notre travail s'est ainsi focalisé sur l'étude de l'influence de p53 sur la modulation de la sécrétion de protéines par les tumeurs du poumon. Nous avons ainsi développé un procédé d'analyse protéomique adapté, basé notamment sur un marquage iTRAQ, une séparation par isoélectrofocalisation de type OFFGEL et une analyse LC-MALDI-MS/MS. Ce procédé a été appliqué à l'étude du rôle joué par l'expression conditionnelle de p53 sur la modulation du secretome d'une lignée cellulaire d'adénocarcinome du cancer du poumon non à petites cellules. Plusieurs protéines d'intérêt ont ainsi été caractérisées et confirmées in vivo chez la souris au niveau tumoral et plasmatique. Ces résultats apportent une meilleure compréhension du rôle primordial joué par l'altération de p53 dans la modulation de l'environnement tumoral et font des secretomes cellulaires un modèle de choix pour l'identification de marqueurs tumoraux.Cancer is a real public health problem and will represent in 2010 the first cause of mortality. So the knowledge of this disease and its mechanisms remains a great challenge. Malignant processes such as metastasis, invasion, or angiogenesis are tightly dependent on the composition of the extracellular medium, which is itself affected by the release of proteins by the tumor cells. The mutation of pro- and anti-oncogenic factors plays an important role in tumor progression. In this work, we want to ask the following major question: is it interesting to study by proteomics the secreted proteins by tumor to better understand tumorigenesis mechanisms and is it useful for clinical biomarker discovery? We focused on lung cancer which is the cancer with the greater mortality and incidency frequences in the world. This cancer has the greater p53 mutation rates. This protein is a major tumor suppressor known to modulate the release of proteins by the tumor cells; however, while p53-modulated intracellular proteins have been extensively studied, little is known concerning their extracellular counterparts. Here, we developed a proteomics process using iTRAQ labeling, OFFGEL isoelectric focusing and LC-MALDI-MS/MS analysis efficient to the study of this class of proteins. We used it to characterize the p53-dependent secretome of a lung tumor model in vitro. We identified 909 proteins released by these cells, among which 91 are p53-modulated. This differential secretome analysis promises more detailed of how the loss of wt-p53 contributes to tumorigenic processes through the modulation of secreted proteins. We also demonstrated that the modulation of exported proteins can be detected in vivo in total protein extracts and plasma of tumor-bearing mice. This is the first report establishing that the in vitro cell line secretome is reliable and reflects the extracellular release of proteins from tumor cells in vivo and could be used to identify putative tumor markers.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

The Product Lifecycle Management in the pharmaceutical market

Depuis plusieurs années, les entreprises pharmaceutiques ont dû faire face à des obligations de plus en plus fortes, à la fois sur le plan économique, réglementaire et éthique. Ces contraintes ont à présent un impact visible sur le processus du développement qui n a de cesse de se rallonger malgré un investissement croissant des ressources. Elles influencent également le dynamisme du marché. Afin d optimiser les bénéfices financiers des médicaments princeps mis sur le marché, les entreprises pharmaceutiques utilisent un concept largement répandu dans le milieu industriel : le Product Life Cycle Management (PLCM). Adapté aux spécificités et aux limites du domaine pharmaceutique, le PLCM élabore, planifie et manage les stratégies et les actions qui en découlent, dans le but évident de maximiser le retour sur investissement. Pourtant, malgré les ressources conséquentes allouées au développement et l optimisation du management du composé durant toute son existence, le modèle actuel du cycle de vie du médicament semble avoir atteint ses limites. On observe en effet depuis 2011 un des plus forts ralentissements de la croissance du marché pharmaceutique comparée à celles de ces dernières décennies. Ce constat pourrait amener les industriels à mettre en place dans le management de leur produit un modèle rénové voire totalement réinventé et, ainsi, trouver une solution concrète afin de faire sortir le marché pharmaceutique de son marasme.For many years, pharmaceutical companies have faced growing obligations, both in terms of economic, regulatory and ethics. These constraints are now having a noticeable impact on the development process. They are responsible of the steadily increase of development time despite growing investment in resources. They also influence the market dynamics. To maximize the financial benefits of original medicines marketed, pharmaceutical industry uses a concept widely applied in the industrial field: the "Product Life Cycle Management" (PLCM). Following the adaptation to specificities and limitations of the pharmaceutical sector, the PLCM designs, plans and manages the various strategies and actions arising from in the clear aim of maximizing return on investment. Nevertheless, despite substantial resources allocated to the development and optimization of the management of the compound throughout its lifetime, the current model of the life cycle of drug seems to have reached its limits. lndeed, since 2011, it has been observed one of the most important slowdown in growth in the pharmaceutical market. This observation could lead industrialists to implement in their product management a renewed model and thus to find an appropriate solution to boost the pharmaceutical market.GRENOBLE1-BU Médecine pharm. (385162101) / SudocSudocFranceF

Etude et caractérisation de l'expression de nouveaux transporteurs de zinc de la famille ZnT chez les mammifères

Le zinc est un oligo-élément essentiel pour la vie. Le zinc n'est pas seulement un nutriment important, ou un cofacteur de nombreuses enzymes et de facteurs de transcription, il est désormais considéré comme un médiateur intracellulaire. L'homéostasie du zinc résulte de la coordination de diverses protéines: les ZIP, les métallothionéines et les ZnT appartenant à la famille CDF. Le récent décryptage du génome humain a permis d'identifier de nouveaux gènes, ainsi nous avons pu caractériser deux nouveaux gènes de la famille SLC30, nommés SLC30A8 et SLC30A JO. L 'homéostasie du zinc est maintenue par l'action de ces protéines dont la transcription est ellemême dépendante en partie de la concentration en zinc extracellulaire. En cas de carence, les taux de transcription de ZnT -S,-Sc et 7 sont augmentés. Ces transporteurs, que nous avons localisés au niveau de l'appareil de Golgi, pourraient permettre aux protéines néo-synthétisées l'apport en zinc nécessaire à leur fonctionnalité. Nous avons également montré que la protéine ZnT-8 est un transporteur du zinc spécifique des cellules sécrétrices d'insuline, localisé au niveau même des vésicules contenant l'insuline, et dont la régulation de la transcription, tout comme l'insuline, est dépendante du taux de glucose extracellulaire. Le zinc est impliqué dans tous les aspects métaboliques et structuraux des différents compartiments cellulaires. C'est pourquoi la connaissance de ce contrôle cellulaire du zinc est indispensable à une modélisation et à une compréhension du fonctionnement de la cellule.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF