Das tumortherapeutische Potential optimierter Agonisten der Rezeptoren des Apoptose-induzierenden Liganden TRAIL

Trotz der Entwicklung neuer Wirkstoffen und verbesserter Therapien ist die Bekämpfung von Tumoren weiterhin eine große Herausforderung. Apo-2L oder „tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis ligand“ (TRAIL), TRAIL, ist ein Mitglied der TNF-Familie und ein vielversprechendes Protein für die Krebstherapie, weil es selektiv in transformierten, nicht aber in gesunden Zellen Apoptose induziert. Zudem scheint das TRAIL-System die Resistenz von vielen Tumoren gegenüber derzeitigen Behandlungs-Strategien, die im wesentlichen aus Chemotherapie und Bestrahlung bestehen, überwinden zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zuerst rekombinante multimerisierte Einzelkettenantikörperfragmente mit den Spezifitäten anti-TRAIL-R2 und anti-CD95 (APO-1/Fas) hergestellt und charakterisiert. Aus Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper gegen TRAIL-R2 und CD95 produzieren, wurden nach RNA-Isolierung und cDNA-Synthese die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene mittels PCR amplifiziert. Die Herstellung der Expressionsvektoren erfolgte durch C-terminale Fusion der VH- und VL-Expressionskassetten an die Multimerisierungsdomäne eines modifizierten Leuzin-Zippers. Nach Transformation von E.coli mit den Expressionsvektoren und Expression der rekombinanten Proteine wurde die Spezifität und Aktivität der scFv-anti-TRAIL-R2- und scFv-anti-APO-1-Fragmente nach erfolgreicher in vitro Rückfaltung untersucht. Funktionelle Bindung von scFv-anti-TRAIL-R2-Antikörperfragmenten konnte auf TRAIL-R2-exprimierenden Tumorzellen durch FACS-Analyse nachgewiesen werden. Die lytische Aktivität des Antikörperderivates auf verschiedenen Tumorzellen war nur minimal. Im Falle des scFv-anti-APO-1-Antikörperfragmentes konnte sowohl Bindung, als auch zytotoxische Aktivität auf CD95-exprimierenden Tumorzellen gezeigt werden. Das agonistische Potential war jedoch nicht höher als beim Ausgangsantikörper anti-APO-1. Zudem wurde in dieser Arbeit eine hochaktive rekombinante Form von TRAIL, IZ-TRAIL, entwickelt. Rekombinant in E.coli exprimiertes IZ-TRAIL konnte in großen Mengen durch sequentielle Affintitätschromatographie gereinigt werden. Hohe anti-tumorale Wirksamkeit von IZ-TRAIL als Einzeltherpeutikum sowie in Kombination mit Chemotherapeutika wurde auf zahlreichen Tumorzellen in vitro gezeigt. Trotz der hohen Wirksamkeit auf Tumorzellen, konnte keine Zytotoxizität in der Maus und auf frisch isolierten primären humanen Hepatozyten, auch in Kombination mit diversen Chemotherapeutika nachgewiesen werden. Mit IZ-TRAIL wurde eine TRAIL-Version entwickelt, die im Vergleich zu nicht getaggten TRAIL-Versionen eine hohe anti-tumorale Wirkung hat, und gleichzeitig für primäre Zellen nicht toxisch ist

Das tumortherapeutische Potential optimierter Agonisten der Rezeptoren des Apoptose-induzierenden Liganden TRAIL

Trotz der Entwicklung neuer Wirkstoffen und verbesserter Therapien ist die Bekämpfung von Tumoren weiterhin eine große Herausforderung. Apo-2L oder „tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis ligand“ (TRAIL), TRAIL, ist ein Mitglied der TNF-Familie und ein vielversprechendes Protein für die Krebstherapie, weil es selektiv in transformierten, nicht aber in gesunden Zellen Apoptose induziert. Zudem scheint das TRAIL-System die Resistenz von vielen Tumoren gegenüber derzeitigen Behandlungs-Strategien, die im wesentlichen aus Chemotherapie und Bestrahlung bestehen, überwinden zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zuerst rekombinante multimerisierte Einzelkettenantikörperfragmente mit den Spezifitäten anti-TRAIL-R2 und anti-CD95 (APO-1/Fas) hergestellt und charakterisiert. Aus Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper gegen TRAIL-R2 und CD95 produzieren, wurden nach RNA-Isolierung und cDNA-Synthese die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene mittels PCR amplifiziert. Die Herstellung der Expressionsvektoren erfolgte durch C-terminale Fusion der VH- und VL-Expressionskassetten an die Multimerisierungsdomäne eines modifizierten Leuzin-Zippers. Nach Transformation von E.coli mit den Expressionsvektoren und Expression der rekombinanten Proteine wurde die Spezifität und Aktivität der scFv-anti-TRAIL-R2- und scFv-anti-APO-1-Fragmente nach erfolgreicher in vitro Rückfaltung untersucht. Funktionelle Bindung von scFv-anti-TRAIL-R2-Antikörperfragmenten konnte auf TRAIL-R2-exprimierenden Tumorzellen durch FACS-Analyse nachgewiesen werden. Die lytische Aktivität des Antikörperderivates auf verschiedenen Tumorzellen war nur minimal. Im Falle des scFv-anti-APO-1-Antikörperfragmentes konnte sowohl Bindung, als auch zytotoxische Aktivität auf CD95-exprimierenden Tumorzellen gezeigt werden. Das agonistische Potential war jedoch nicht höher als beim Ausgangsantikörper anti-APO-1. Zudem wurde in dieser Arbeit eine hochaktive rekombinante Form von TRAIL, IZ-TRAIL, entwickelt. Rekombinant in E.coli exprimiertes IZ-TRAIL konnte in großen Mengen durch sequentielle Affintitätschromatographie gereinigt werden. Hohe anti-tumorale Wirksamkeit von IZ-TRAIL als Einzeltherpeutikum sowie in Kombination mit Chemotherapeutika wurde auf zahlreichen Tumorzellen in vitro gezeigt. Trotz der hohen Wirksamkeit auf Tumorzellen, konnte keine Zytotoxizität in der Maus und auf frisch isolierten primären humanen Hepatozyten, auch in Kombination mit diversen Chemotherapeutika nachgewiesen werden. Mit IZ-TRAIL wurde eine TRAIL-Version entwickelt, die im Vergleich zu nicht getaggten TRAIL-Versionen eine hohe anti-tumorale Wirkung hat, und gleichzeitig für primäre Zellen nicht toxisch ist

NoxO1 knockout promotes longevity in mice

According to the free radical theory of aging, reactive oxygen species (ROS) have been proposed to be a major cause of aging for a long time. Meanwhile, it became clear that ROS have diverse functions in a healthy organism. They act as second messengers, and as transient inhibitors of phosphatases and others. In fact, their detrimental role is highly dependent on the context of their production. NADPH oxidases (Nox) have been discovered as a controllable source of ROS. NoxO1 enables constitutive ROS formation by Nox1 by acting as a constitutively active cytosolic subunit of the complex. We previously found that both Nox1 and NoxO1 were highly expressed in the colon, and that NoxO1-/- deficiency reduces colon health. We hypothesized that a healthy colon potentially contributes to longevity and NoxO1 deficiency would reduce lifetime, at least in mouse. In contrast, here we provide evidence that the knockout of NoxO1 results in an elongated life expectancy of mice. No better endothelial function, nor an improved expression of genes related to longevity, such as Sirt1, were found, and therefore may not serve as an explanation for a longer life in NoxO1 deficiency. Rather minor systemic differences, such as lower body weight occur. As a potential reason for longer life, we suggest better DNA repair capacity in NoxO1 deficient mice. Although final fatal DNA damage appears similar between wildtype and NoxO1 knockout animals, we identified less intermediate DNA damage in colon cells of NoxO1-/- mice, while the number of cells with intact DNA is elevated in NoxO1-/- colons. We conclude that NoxO1 deficiency prolongs lifetime of mice, which correlates with less intermediate and potentially fixable DNA damage at least in colon cells

Apoptosis and Cancer Therapy: From Cutting-edge Science to Novel Therapeutic Concepts

The death ligand TRAIL was discovered just over 10 years ago. In this chapter, we summarize the most important findings on the biochemistry, biology and potential therapeutic applicability of this promising novel cytokine. We address a number of eminent questions. How does TRAIL apoptosis signaling work and what is special about it? Why is this member of the tumor necrosis factor family of cytokines so interesting for cancer researchers and immunologists? What is the physiological role of the TRAIL\u2013TRAIL receptor system? We cannot provide full answers to all of these questions; however, we intend to point out to the reader the most important unsolved scientific questions regarding the biology of this fascinating cytokine and its receptors