A novel model of Miller Fisher syndrome to study motor axon terminal regeneration

The neuromuscular junction (NMJ) is a ‘tripartite’ synapse, composed of the presynaptic motor axon terminal (MAT), the muscle fiber and perisynaptic Schwann cells (PSCs). NMJ functionality is essential for the execution of body movements and it is anatomically exposed, becoming an easy target of bacterial and animal neurotoxins, toxic chemicals, mechanical trauma, and autoimmune diseases. In the Miller Fisher Syndrome (MFS) autoantibodies against specific gangliosides (>90% GQ1b) bind to MAT and in turn activate the complement system cascade at its surface, leading to nerve degeneration. Such damage is reversible, as the motor neuron is able to fully regenerate and restore neurotransmission. PSCs are main supporters of NMJ regeneration: to date, however, the current understanding of PSCs role in this autoimmune neuropathy is mostly phenomenological, and molecular studies are needed. It was recently reported that the degenerating MAT release alarm signals (alarmins) able to activate the pro-regenerating phenotype of PSCs. Therefore, MAT can be considered an active player of its own regeneration. In addition, many other signals are thought to be generated by all the three main components of the NMJ, thus generating a complex inter-cellular communication network, which has been only partially identified. In order to better elucidate the molecular and cellular events driving PSCs response to MAT damage in MFS, we recently developed a novel in vivo MFS model. The combination of FS3, a monoclonal antibody against gangliosides related to MFS, and normal human serum (NHS) as a source of complement, administered subcutaneously in LAL muscles and intramuscularly in soleus muscle in mice, causes the degeneration of MAT. Soon after MAT destruction, neuronal debris are engulfed and digested by PSCs. Within few days after injection MAT regrowth is morphologically and functionally complete, as assessed by immunofluorescence analysis and electrophysiological recordings. The effect is antibody- and complement-dependent, as no MAT degeneration takes place in the absence of FS3, nor when NHS is heat-inactivated. To identify the neuronal alarmins responsible for PSCs activation and the signaling pathways engaged, we have parallely set up an in vitro MFS model consisting of administration of FS3 plus NHS to primary cerebellar neurons and spinal cord motor neurons, which causes a complement-dependent massive Ca2+ overload in neurite, together with the formation of neurite enlargements, named bulges. Bulges are sites of accumulation of swollen and dysfunctional mitochondria, and of localized hydrogen peroxide (H2O2) production. Hydrogen peroxide is an alarm signal for SCs. Indeed, in FS3 plus NHS attacked neurons-SCs co-cultures, neuron-derived H2O2 induces activation of the ERK1/2 pathway in SCs, a known crucial player of the switch toward a pro-regenerative phenotype of SCs. In addition, we identified adenosine triphosphate (ATP) as an additional alarmin involved in SCs activation. Indeed, primary neurons exposed to FS3 plus NHS release ATP in the extracellular medium, which in turn evokes intracellular calcium spikes within SCs in co-cultures with neurons. These spikes were significantly abolished in the presence of the ATP-inactivating enzyme apyrase in the incubation medium. Furthermore, experiments with a FRET-based cyclic AMP (cAMP) sensor show that, upon FS3 plus NHS addition in neurons-SCs co-cultures, cAMP levels rise in SCs, and this event eventually results in an ATP-dependent increased phosphorylation the transcription factor CREB (cAMP response element-binding protein). In conclusion, the work performed during this PhD project has led to the development of novel in vitro and in vivo models of MFS, in order to study the molecular communication between MAT and PSCs. Hydrogen peroxide and ATP were found to be important neuronal alarmins, able to activate pro-regenerative pathways within SCs. We believe these results throw light on the molecular and cellular events taking place in MFS, and may well be extended to other MAT affecting pathologies.

Percezione dell\u2019offerta turistico-balneare in Italia: aspettative, soddisfazione e conoscenze degli aspetti fisico-gestionali delle spiagge

Nell’estate 2015 è stata eseguita un’indagine della percezione degli utenti delle spiagge italiane. L’indagine, svolta in 41 spiagge di 11 Regioni, ha comportato la raccolta di 5.168 questionari. Nello studio le spiagge sono state suddivise secondo alcune classificazioni proposte in letteratura (classificazione antropogenica, delle attività presenti, di forma, di grado di urbanizzazione, sedimentologica). La frequentazione maggiore è stata riscontrata in spiagge urbane, a carattere ricreativo, lineari e sabbiose, ma sono risultate significative anche le presenze nelle spiagge rurali, di villaggio e resort. Il turismo prevalente è di tipo familiare, abituale e che soggiorna nelle località per periodi lunghi. La maggioranza degli utenti non è residente nel comune in cui trascorre le vacanze, ma sceglie la località turistica per il mare, la spiaggia e per la sua vicinanza. Gli elementi che qualificano una spiaggia sono principalmente quattro: mare pulito, pulizia della spiaggia, buona qualità dei servizi e delle strutture balneari, panorama e paesaggio. Questi elementi, se correlati con la tipologia di spiaggia scelta dagli utenti, dimostrano che il mare pulito e la buona qualità dell’acqua si riscontrano in spiagge di villaggio, resort e pocket beach ricadenti fuori dai principali centri urbani costieri. Buona qualità della spiaggia, dei servizi e della sicurezza sono principalmente riscontrate in spiagge di villaggio e urbane, di forma lineare od a tratti lineari e a baia artificiale. Infine, il paesaggio migliore secondo gli utenti è quello che si gode in spiagge resort, a bassa densità di urbanizzazione (spiagge di villaggio e rurali). Inoltre dall’indagine emerge come non vi sia una conoscenza profonda della gestione delle spiagge e delle opere che si realizzano per la protezione degli arenili; ciò si riflette nella scarsa disponibilità a pagare del turista per preservare la spiaggia

Data for the analysis of willingness to pay for Italian beaches

The data presented herein relates to the article entitled \u201cWillingness to pay for management and preservation of natural, semi-urban and urban beaches in Italy\u201d [1]. Data of several Italian beaches are collected considering shape, anthropogenic characteristics, use, activity and urbanization levels. Descriptive statistics of beach characteristics and beach users are presented, on the basis of about 5,000 interviews

Schwann cells are activated by ATP released from neurons in an in vitro cellular model of Miller Fisher syndrome

The neuromuscular junction is exposed to different types of insult, including mechanical trauma, toxins and autoimmune antibodies and, accordingly, has retained through evolution a remarkable ability to regenerate. Regeneration is driven by multiple signals that are exchanged among the cellular components of the junction. These signals are largely unknown. Miller Fisher syndrome is a variant of Guillain-Barr\ue9 syndrome caused by autoimmune antibodies specific for epitopes of peripheral axon terminals. Using an animal model of Miller Fisher syndrome, we recently reported that a monoclonal anti-polysialoganglioside GQ1b antibody plus complement damages nerve terminals with production of mitochondrial hydrogen peroxide, which activates Schwann cells. Several additional signaling molecules are likely to be involved in the activation of the regeneration program in these cells. Using an in vitro cellular model consisting of co-cultured primary neurons and Schwann cells, we found that ATP is released by neurons injured by the anti-GQ1b antibody plus complement. Neuron-derived ATP acts as an alarm messenger for Schwann cells, where it induces the activation of intracellular pathways, including calcium signaling, cAMP and CREB, which, in turn, produce signals that promote nerve regeneration. These results contribute to defining the cross-talk taking place at the neuromuscular junction when it is attacked by anti-gangliosides autoantibodies plus complement, which is crucial for nerve regeneration and is also likely to be important in other peripheral neuropathies

A novel model of Miller Fisher syndrome to study motor axon terminal regeneration

The neuromuscular junction (NMJ) is a ‘tripartite’ synapse, composed of the presynaptic motor axon terminal (MAT), the muscle fiber and perisynaptic Schwann cells (PSCs). NMJ functionality is essential for the execution of body movements and it is anatomically exposed, becoming an easy target of bacterial and animal neurotoxins, toxic chemicals, mechanical trauma, and autoimmune diseases. In the Miller Fisher Syndrome (MFS) autoantibodies against specific gangliosides (>90% GQ1b) bind to MAT and in turn activate the complement system cascade at its surface, leading to nerve degeneration. Such damage is reversible, as the motor neuron is able to fully regenerate and restore neurotransmission. PSCs are main supporters of NMJ regeneration: to date, however, the current understanding of PSCs role in this autoimmune neuropathy is mostly phenomenological, and molecular studies are needed. It was recently reported that the degenerating MAT release alarm signals (alarmins) able to activate the pro-regenerating phenotype of PSCs. Therefore, MAT can be considered an active player of its own regeneration. In addition, many other signals are thought to be generated by all the three main components of the NMJ, thus generating a complex inter-cellular communication network, which has been only partially identified. In order to better elucidate the molecular and cellular events driving PSCs response to MAT damage in MFS, we recently developed a novel in vivo MFS model. The combination of FS3, a monoclonal antibody against gangliosides related to MFS, and normal human serum (NHS) as a source of complement, administered subcutaneously in LAL muscles and intramuscularly in soleus muscle in mice, causes the degeneration of MAT. Soon after MAT destruction, neuronal debris are engulfed and digested by PSCs. Within few days after injection MAT regrowth is morphologically and functionally complete, as assessed by immunofluorescence analysis and electrophysiological recordings. The effect is antibody- and complement-dependent, as no MAT degeneration takes place in the absence of FS3, nor when NHS is heat-inactivated. To identify the neuronal alarmins responsible for PSCs activation and the signaling pathways engaged, we have parallely set up an in vitro MFS model consisting of administration of FS3 plus NHS to primary cerebellar neurons and spinal cord motor neurons, which causes a complement-dependent massive Ca2+ overload in neurite, together with the formation of neurite enlargements, named bulges. Bulges are sites of accumulation of swollen and dysfunctional mitochondria, and of localized hydrogen peroxide (H2O2) production. Hydrogen peroxide is an alarm signal for SCs. Indeed, in FS3 plus NHS attacked neurons-SCs co-cultures, neuron-derived H2O2 induces activation of the ERK1/2 pathway in SCs, a known crucial player of the switch toward a pro-regenerative phenotype of SCs. In addition, we identified adenosine triphosphate (ATP) as an additional alarmin involved in SCs activation. Indeed, primary neurons exposed to FS3 plus NHS release ATP in the extracellular medium, which in turn evokes intracellular calcium spikes within SCs in co-cultures with neurons. These spikes were significantly abolished in the presence of the ATP-inactivating enzyme apyrase in the incubation medium. Furthermore, experiments with a FRET-based cyclic AMP (cAMP) sensor show that, upon FS3 plus NHS addition in neurons-SCs co-cultures, cAMP levels rise in SCs, and this event eventually results in an ATP-dependent increased phosphorylation the transcription factor CREB (cAMP response element-binding protein). In conclusion, the work performed during this PhD project has led to the development of novel in vitro and in vivo models of MFS, in order to study the molecular communication between MAT and PSCs. Hydrogen peroxide and ATP were found to be important neuronal alarmins, able to activate pro-regenerative pathways within SCs. We believe these results throw light on the molecular and cellular events taking place in MFS, and may well be extended to other MAT affecting pathologies.  La giunzione neuromuscolare (neuromuscular junction, NMJ) è una sinapsi ‘tripartita’, composta da un terminale assonico di un motoneurone (motor axon terminal, MAT), una fibra muscolare postsinaptica, e da cellule di Schwann perisinaptiche (perisynaptic Schwann cells, PSC). La funzionalità della NMJ è essenziale per l’esecuzione dei movimenti corporei. Tuttavia la sua anatomia la rende particolarmente esposta ad una vasta gamma di stimoli patologici, quali neurotossine animali e batteriche, sostanze tossiche, traumi meccanici e malattie autoimmuni. Nella sindrome di Miller Fisher (Miller Fisher Syndrome, MFS), auto-anticorpi riconoscono specifici gangliosidi (>90% GQ1b) presenti nel MAT e attivano la cascata del complemento alla sua superficie, causandone la degenerazione. Questo danno è reversibile, in quanto il MAT è in grado di rigenerare completamente e di ristabilire la trasmissione sinaptica. Le PSC sono tra i principali effettori della rigenerazione della NMJ. Ad oggi, tuttavia, l’attuale comprensione dei ruoli di queste cellule in questa neuropatia autoimmune è principalmente fenomenologica, e ulteriori studi molecolari. È stato riportato che il MAT in degenerazione rilascia segnali di allarme (alarmine) capaci di attivare il fenotipo di pro-rigenerazione delle PSC. Dunque si può dedurre che il MAT gioca un ruolo attivo nel processo della propria degenerazione. Inoltre è probabile che molti altri segnali siano generati da parte di tutti e tre i componenti della NMJ, che generano così un network complesso di comunicazione intercellulare, il quale è stato solo parzialmente compreso. Nel progetto di dottorato qui presentato è stato sviluppato un nuovo modello in vivo di MFS, allo scopo di chiarire gli eventi molecolari e cellulari che avvengono nelle PSC in seguito a danno del MAT osservato nella MFS. Ciò è stato permesso tramite l’utilizzo di FS3, un anticorpo monoclonale che riconosce gangliosidi associati alla MFS, e siero umano (normal human serum, NHS), utilizzato come fonte di proteine del complemento. La amministrazione subcutanea nel muscolo LAL, o intramuscolare nel muscolo soleo, della combinazione di questi due elementi induce la degenerazione del MAT, e i suoi frammenti vengono fagocitati e degradati dalle PSC. Entro pochi giorni dall’iniezione la rigenerazione del MAT è completa sia a livello morfologico che funzionale, come evidenziato da analisi di immunofluorescenza ed elettrofisiologiche. Gli effetti osservati sono strettamente dipendenti dall’anticorpo e dal sistema del complemento, in quanto non viene osservata neurodegenerazione in assenza di FS3 o quando il NHS viene inattivato al calore. Allo scopo di identificare le alarmine neuronali responsabili dell’attivazione delle PSC e le conseguenti risposte molecolari di quest’ultime, è stato parallelamente sviluppato un modello in vitro di MFS, che consiste nell’esposizioneì della combinazione di FS3 e NHS (FS3+NHS) a colture primarie di neuroni cerebellari o di motoneuroni da midollo spinale. Ciò causa un’entrata massiccia e incontrollata di calcio (Ca2+) a livello dei neuriti, associata alla formazione di protuberanze, o bulges, a livello dei neuriti stessi. Questi bulges sono siti di accumulo di mitocondri gonfi e disfunzionali, e di produzione di perossido di idrogeno (H2O2). Il perossido di idrogeno è un segnale di allarme per le cellule di Schwann (Schwann cells, SC). Infatti in co-colture di neuroni e SC, il H2O2 derivante dai neuroni attaccati da FS3+NHS induce l’attivazione nelle SC del pathway di ERK1/2, conosciuto per il suo importante ruolo di induzione del fenotipo pro-rigenerazione delle SC. Inoltre, tramite il modello in vitro di MFS, è stata identificata una seconda alarmina coinvolta nell’attivazione delle SC, l’adenosina trifosfato (ATP). Infatti, neuroni primari esposti al complesso FS3+NHS rilasciano nel mezzo extracellulare ATP, che a sua volta induce oscillazioni intracellulari di Ca2+ nelle SC. Queste oscillazioni sono abolite in presenza di apirasi, un enzima che degrada l’ATP, nel mezzo di incubazione. In aggiunta, esperimenti con un sensore FRET per l’AMP ciclico (cAMP) hanno mostrato che i livelli di SC aumentano in co-colture di neuroni e SC in seguito al danno neuronale esercitato da FS3+NHS. All’aumento di cAMP intracellulare osservata ne consegue un’aumentata fosforilazione (ovvero attivazione) del fattore di trascrizione CREB (cAMP response element-binding protein), anch’essa ATP-dipendente. In conclusione, il lavoro svolto in questo progetto di dottorato ha portato allo sviluppo di nuovo modelli in vivo e in vitro di MFS. Questi sono stati utilizzati per lo studio della comunicazione molecolare tra il MAT e le PSC. Il perossido di idrogeno e l’ATP sono stati identificati come importanti alarmine neuronali, capaci di attivare il fenotipo pro-rigenerazione delle SC. Crediamo che questi risultati contribuiscano a gettare luce sugli eventi molecolari e cellulari che avvengono alla NMJ nella MFS, e che queste conoscenze possano venire estese anche ad altre patologie che affliggono il MAT.

THE RELATIONSHIP BETWEEN BEACH GEOMORPHOLOGY AND SUSTAINABLE TOURISM IN SANDY BEACHES: A CASE STUDY OF ROSOLINA MARE LITTORAL (VENETO REGION)

Beach carrying capacity assessment can be used as useful tools for planning sustainable tourism destinations. Assuming that the establishment of a maximum number of people can help tourist management, this study used two carrying capacity methods to estimate the carrying capacity of Rosolina Mare (Veneto region). To this purpose, the study considered the geomorphological characteristics of the beaches, the users’ perception and the environmental and management factors of the littoral. Our results suggest that the physical carrying capacity can be defined using geomorphological analyses, while the effective carrying capacity can be evaluated using the users' perception analysis

Risultati preliminari sulla percezione turistica delle spiagge italiane

Le analisi delle aspettative e delle percezioni del turista consentono di evidenziare alcuni punti di forza e di debolezza attribuiti alle località considerate. Mare pulito e qualità delle spiagge, che sono i fattori che maggiormente incidono sulle destinazioni scelte, generalmente soddisfano le aspettative del turista. Al contrario viene denunciata dalla maggioranza degli intervistati la necessità di potenziare le attività ricreative e le attrezzature balneari. Emerge dunque la necessità di una ridefinizione dello stabilimento balneare che viene visto come punto di riferimento per le famiglie e per le attività di svago e divertimento. È evidente che a fronte delle carenze sopraesposte, la percezione turistica può essere anche migliorata valorizzando il rapporto col territorio e il patrimonio artistico, culturale e ambientale delle località per offrire un’alternativa alle giornate in spiaggia