New chromene-based drug candidates for cancer treatment

Dissertação de mestrado em Bioquímica AplicadaCancer is a devastating disease worldwide, with millions of diagnoses per year and many people living with this pathology. Breast cancer is one of the major causes of death in women while male breast cancer represents less than 1% of the total male diagnosed population. Due to this increasing cancer incidence, research in this area has been growing at the same rate. Thus, there is an urgency in discovering new drugs for cancer treatment. The chromene scaffold has been identified in several compounds with anticancer activity. The substitution pattern highly influences the activity and the mode of action and the synthesis of new derivatives is an important element in the search for improved drug candidates. The major aim of this Master thesis was the synthesis of new chromene derivatives with enhanced anticancer activity. Chalcone and chromene derivatives were isolated in good yield through clean reactions using innocuous solvents such as water and ethanol and highly effective aldol condensations. Generally, the reactions were performed at room temperature, leading to the isolation of highly pure compounds. Newly synthetized compounds were tested on cancer cells and a non-tumoral cell line. For the first screening, a range of 51 compounds was assessed for cell survival by SRB assay on MCF-7 cells. Then, only the 22 most active compounds were tested against another breast cancer cell line (HS578t) and cytotoxicity was evaluated for MCF-10 normal cells. Then, a selection of the eight most promising chalcones and chromenes had their IC50 determined for all three cell lines. Finally, some more specific assays were performed and it was found that a selected chromene acted as a cell migration inhibitory agent. Some preliminary results, with protein expression, also showed that this chromene might be causing its anticancer activity through induction of cell-apoptosis. For chalcones, the results suggest an anti-proliferative ability and reduction of membrane integrity. Generally, compounds with halogenated substituents presented enhanced activity comparing to methoxy or methyl groups. More specifically, the bromine atom was often present in the bioactive molecules that proceeded to the final assays and showed to be promising candidates for further studies.O cancro é uma doença devastadora que em todo o mundo apresenta milhões de diagnósticos por ano e muitas pessoas vivem com esta patologia. O cancro da mama é uma das maiores causas de morte entre a população feminina enquanto que, o cancro da mama masculino afeta menos de 1% de todos os diagnósticos oncológicos nos homens. Devido à crescente incidência de cancro, a investigação farmacológica nesta área tem vindo a crescer na mesma proporção. Assim, a descoberta de novas drogas para tratamento oncológico representa uma urgência. O núcleo de cromeno foi identificado em diversos compostos com atividade anticancerígena. O padrão de substituição demonstra afetar a atividade e o modo de ação e a síntese de novos derivados é um elemento importante em investigação para melhorar a ação do candidato. O principal objetivo desta tese de Mestrado era sintetizar novos derivados de cromeno com atividade anticancerígena melhorada. Vários derivados de calconas e cromenos foram isolados com bons rendimentos, através de reações limpas usando solventes inócuos tais como água e etanol, em condensações aldólicas altamente efetivas. Na generalidade, as reações foram realizadas à temperatura ambiente, levando ao isolamento de compostos altamente puros. Os recém-sintetizados compostos foram testados em linhas celulares de cancro e numa linha celular não-tumoral. Num primeiro screening, um lote de 51 compostos foi testado para a viabilidade celular por ensaio com sulforodamina em células MCF-7. Então, apenas os 22 compostos mais ativos foram testados para outra linha celular (HS578t) e a citotoxicidade foi avaliada em células normais MCF-10. Uma série dos oito compostos mais promissores para as três linhas celulares, foi selecionada e teve o IC50 determinado. Finalmente, alguns ensaios mais específicos foram elaborados e registou-se que o único cromeno selecionado apresentou poder para inibição da migração celular. Alguns resultados preliminares, para expressão proteica, clarificaram que este cromeno poderá estar a agir como agente anticancerígeno através da indução da apoptose. Para as calconas testadas, os resultados sugerem uma capacidade antiproliferativa e a redução da integridade membranar. Em geral, os compostos com substituintes halogenados exibiram melhor atividade em comparação com grupos metilo ou metoxilo. Mais especificamente, o átomo de bromo esteve por diversas vezes presente nas moléculas bioativas que procederam para os ensaios finais e demostraram ser candidatos promissores para estudos futuros

Caracterização dos perfis de eficácia anticancerígena e segurança de novos compostos sintéticos

Tese de doutoramento em Ciências da SaúdeCancer is the most devastating and prevalent disease worldwide. Due to the escalating incidence of cancer, research in this area has been expanding the range of new therapeutic approaches to treat this pathology. Still, there is an urgent need to discover novel and effective drugs for cancer treatment, with improved toxicity profiles and able to overcome the acquisition of resistance to current treatments. The chromene nucleus is a promising biological agent and many chromene-based compounds have already been described bearing anticancer potential. The substitution pattern highly influences the activity and their mode of action, and the synthesis of new derivatives is an important element in the search for improved drug candidates. Hence, the major aim of this work is to exploit the anticancer potential of new compounds based on the chromene scaffold and to study their mode of action, using two cancer models: breast cancer (BC) and renal cell carcinoma (RCC). An in vitro characterization of the anticancer activity for the synthesized compounds was performed in both BC and RCC models using a panel of different cancer cell lines. The toxicity of the most active compounds was assessed in non-neoplastic cells and in vivo Caenorhabditis elegans and mouse models. Efficacy studies were performed using the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo and mouse xenograft. For both BC and RCC, the tested compounds revealed IC50 in the nanomolar range with superior selectivity indexes than those obtained for reference drugs. For BC model, the novel compounds were capable to inhibit cell proliferation, induce cell death via apoptosis intrinsic pathway and trigger cell cycle arrest. In vivo, the chromenes were responsible for tumor regression in the CAM model and tumor growth inhibition in mice xenografts. The novel chromenes showed considerably higher IC50 for non-neoplastic cells and no toxicity in C. elegans or mouse models, with preservation of organ structural architecture and biochemical parameters. The chromenes used on the RCC model had a similar mode of action than in BC leading to inhibition of cell proliferation, migration, and invasion, triggering cell death by apoptosis, cell cycle arrest and inhibition of glucose metabolism. In the CAM model, chromenesinduced tumor regression and inhibited angiogenesis. The new chromenes maintained low IC50 in drug resistant cancer cells, with good selectivity indexes, and preserving their anticancer potency. This work provides a valuable contribution to the use of chromene derivatives as anticancer agents for the treatment of BC and RCC even after acquisition of targeted drug resistance. Importantly, the novel compounds revealed a new mode of action, which can be valuable for the treatment of aggressive cancers. Thus, the work performed in this thesis reinforces the importance of the design of novel molecules for cancer treatment, leading to the improvement of current therapeutic options.O cancro é a doença mais devastadora e prevalente em todo o mundo. Devido ao aumento da sua incidência, a investigação nesta área tem ampliado o leque de novas abordagens terapêuticas. Ainda assim, há uma necessidade urgente de descoberta de novos medicamentos, mais eficazes para o tratamento do cancro e com perfis de toxicidade aprimorados e ainda que possam superar a aquisição de resistência aos tratamentos atuais. O núcleo do cromeno está descrito como um agente com diversas propriedades biológicas e numerosos derivados apresentam potencial anticancerígeno. O padrão de substituição influencia a atividade e seu modo de ação, sendo a síntese de novos derivados um elemento crucial na descoberta de melhores candidatos a fármacos. O objetivo principal deste trabalho foi o estudo do potencial anticancerígeno de novos compostos com núcleo de cromeno e a elucidação do seu modo de ação, usando dois modelos de cancro: cancro de mama (CM) e carcinoma de células renais (CCR). A caracterização in vitro da atividade anticancerígena dos compostos foi realizada em ambos os modelos de CM e CCR, usando um painel de linhas celulares cancerígenas. A toxicidade dos compostos mais ativos foi avaliada em células não-neoplásicas e nos modelos in vivo Caenorhabditis elegans e ratinho. Em modelos in vitro de CM, os compostos foram capazes de inibir a proliferação celular, induzir morte pela via intrínseca da apoptose e paragem do ciclo celular. A eficácia dos cromenos com melhor índice de seletividade foi estudada usando os modelos da membrana corioalantóica (CAM) do embrião de galinha e xenógrafos de ratinho. In vivo, os compostos foram responsáveis pela regressão do tumor no modelo CAM e uma inibição do crescimento do tumor em ratinho, com valores de IC50 consideravelmente mais elevados para células não-neoplásicas e sem evidência de toxicidade nos modelos de C. elegans e ratinho, com manutenção da estrutura dos órgãos e parâmetros bioquímicos. Em CCR, os cromenos revelaram um modo de ação idêntico ao observado para CM, inibindo a proliferação celular, migração e invasão, associada à morte celular por apoptose, paragem do ciclo celular e inibição do metabolismo da glucose. No modelo CAM, os cromenos induziram a regressão tumoral e inibiram a angiogénese. Quando testados em células de CCR resistentes a fármacos de referência, os baixos IC50 foram mantidos, com boa seletividade, preservando a sua atividade anticancerígena. Assim, este trabalho constitui uma valiosa contribuição para o uso de derivados de cromeno como agentes anticancerígenos para o tratamento de CM e CCR, mesmo após a aquisição de resistência a terapias-alvo. De realçar, que estes novos compostos apresentam um novo modo de ação com elevado potencial para o tratamento de cancros agressivos. Assim, o trabalho realizado nesta tese reforça a importância do desenho de novas moléculas para o tratamento do cancro, levando ao aprimoramento das opções terapêuticas existentes.Financial support was provided by grants from the Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) through individual fellowship (SFRH/BD/128850/2017) and the Luso-American Development Foundation (R&D@PhD2020/CON1/CAN12). We acknowledge the University of Minho, Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), by the project NORTE-01-0145-FEDER-000055, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF), and by National funds, through the Foundation for Science and Technology (FCT) - project UIDB/50026/2020 and UIDP/50026/2020, and FEDERCOMPETE for financial support through Centro de Química (UID/QUI/00686/2013 and UID/QUI/0686/2016). The NMR spectrometer Bruker Avance III 400 is part of the National NMR Network (RNRMN) and was purchased within the framework of the National Program for Scientific Re-equipment, contract REDE/1517/RMN/2005 with funds from POCI 2010 (FEDER) and FCT. This thesis was also developed under the project NORTE-01-0145-FEDER-000013, by the Northern Portugal Regional Operational Program (NORTE 2020), through the European Regional Development Fund (FEDER) and the Competitiveness Factors Operational Program (COMPETE) and by National funds, through the Foundation for Science and Technology (ref. POCI-01- 0145-FEDER-007038) and ICVS Scientific Microscopy Platform, member of the national infrastructure PPBI - Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI POCI-01-0145-FEDER-022122. Part of this thesis is included in the international patent WO/2020/261242, funded through NORTE-01-0145- FEDER-046826