Quorum Sensing is essential for an effective symbiosis in R. leguminosarum UPM791.

The implications of Quorum Sensing in the establishment of a successful symbiosis of Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) with legume plants are discussed in this work. In order to analyze the significance and regulation of the production of AHL signal molecules, mutants deficient in each of the two QS systems present in Rlv UPM791 were constructed. A detailed analysis of the effect of these mutations on growth, AHL production, biofilm formation and symbiosis with pea, vetch and lentil plants has been carried out

Efecto de los sistemas de Quorum Sensing sobre la eficiencia simbiótica de R. leguminosarum UPM791

Rhizobium leguminosarum bv viciae (Rlv) es una alfa-proteobacteria capaz de establecer una simbiosis diazotrófica con distintas leguminosas. Uno de los factores implicados en el establecimiento de la simbiosis es el sistema de comunicación intercelular conocido como Quorum Sensing (QS). Mediante este sistema, las bacterias actúan de manera coordinada en respuesta a cambios en la densidad de población a través de la producción y detección de señales extracelulares. El genoma de Rlv UPM791 contiene dos sistemas tipo luxRI mediados por señales de tipo N-acyl-homoserina lactonas (AHLs): el sistema rhiRI, codificado en el plásmido simbiótico, produce C6-HSL, C7-HSL y C8-HSL; y el sistema cinRI, localizado en el cromosoma, produce 3-OH-C14:1-HSL. Con el fin de analizar el significado y la regulación de los sistemas de QS en esta bacteria endosimbiótica se generaron mutantes defectivos en cada uno de los sistemas de QS, y se llevó a cabo un análisis detallado sobre la producción de AHLs y la simbiosis con plantas de guisante, veza y lenteja. El sistema rhiRI se necesita para un comportamiento simbiótico normal, dado que la mutación en rhiI reduce considerablemente la eficiencia simbiótica. rhiR es esencial para la fijación de nitrógeno en ausencia del plásmido pUPM791d. Asimismo, mutaciones en el sistema cinRIS mostraron también un importante efecto en simbiosis. El mutante ?cinRIS no produce la señal 3-OH-C14:1-HSL, y da lugar a nódulos blancos e inefectivos, carentes de bacteroides. El mutante ?cinI, incapaz de producir AHLs, no forma nódulos en ninguna de las leguminosas utilizadas. El análisis genético reveló que dicha mutación origina la inestabilización del plásmido simbiótico por un mecanismo dependiente de cinI que no ha sido aclarado. Los resultados obtenidos sugieren un papel relevante de los sistemas de Quorum Sensing de Rlv UPM791 en los primeros estadíos de la simbiosis, e indican la existencia de un modelo de regulación dependiente de QS significativamente distinto a los que se han descrito previamente en otras cepas de R. leguminosarum

DmeRF system is required for nickel and cobalt resistance in Rhizobium leguminosarum bv. viciae.

A member of the Cation Diffusion Facilitator (CDF) family with high sequence similarity to DmeF (Divalent metal efflux) from Cupridavirus metallidurans was identified in Rhizobium leguminosarum bv. viciae UPM1137. The R. leguminosarum dmeF mutant strain was highly sensitive to Co2+ and moderately sensitive to Ni2+, but its tolerance to other metals such as Zn2+, Cu2+ or Mn2+ was unaffected. An open reading frame located upstream of R. leguminosarum dmeF, designated dmeR, encodes a protein homologous to the nickel and cobalt regulator RcnR from E.coli. Expression of the dmeRF operon was induced by nickel and cobalt ions in free-living cells, likely by alleviating DmeR-mediated transcriptional repression of the operon

Identificación y caracterización funcional de sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel en Rhizobium leguminosarum bv. viciae

La homeostasis de metales como níquel, cobalto, cobre o zinc es un proceso delicado en procariotas. Estos metales de transición son, por un lado imprescindibles para el mantenimiento del metabolismo celular, pero por otro muy tóxicos a elevadas concentraciones. Por este motivo, los microorganismos han desarrollado mecanismos para regular su concentración intracelular, tales como bombas de flujo de metales, secuestradores intra y extracelulares o enzimas detoxificadoras

Análisis de la adaptación de la fase endosimbiótica de Rhizobium leguminosarum bv. viciae a diferentes hospedadores

Los rizobios son alfa-proteobacterias capaces de infectar las raíces de las leguminosas e inducir en las mismas la formación de un nuevo órgano, el nódulo radicular. En dicho nódulo las células bacterianas, diferenciadas en bacteroides especializados en la fijación de nitrógeno, están rodeadas de una membrana peribacteroidal a través de cual la planta controla el intercambio de nutrientes hacia y desde el bacteroide. La adaptación de las bacterias al estilo de vida simbiótico es el resultado de un proceso de co-evolución entre ambos socios en el que se produce el intercambio de fuentes carbonadas y nitrógeno fijado en forma de amonio. En el proceso de establecimiento de la simbiosis se han descrito compuestos de diversa naturaleza química (flavonoides, lipoquitooligosacáridos, EPS) que median un reconocimiento específico entre el rizobio y la leguminosa.1 Sin embargo, el intercambio de señales no termina con la formación del nódulo. El funcionamiento de la simbiosis Rhizobium-leguminosa supone el ajuste metabólico de ambos componentes simbióticos en proceso cuyos detalles aún se desconocen. Uno de los objetivos de nuestro laboratorio se centra en el estudio de la adaptación de Rhizobium a la simbiosis analizando cómo la bacteria responde al ambiente nodular proporcionado por la planta. Recientemente se ha descrito que en el caso de las leguminosas que inducen nódulos indeterminados (con actividad meristemática persistente) como Medicago, Pisum, o Vicia, la planta envía al bacteroide una batería de múltiples péptidos denominados NCR (Nodule-specific Cystein-Rich). de los que no se conoce la función concreta, aunque se ha demostrado que algunos de ellos son capaces de inducir modificaciones en células en cultivo similares a las descritas en bacteroides (inhibición de la división celular, endorreduplicación y alteraciones en la permeabilidd de la membrana).2 La hipótesis actual es que la acción combinada de los NCR controla parcial o totalmente la fisiología de la bacteria induciendo su diferenciación en bacteroide y convirtiéndole en algo similar a un ?esclavo metabólico? cuya función esencial es la fijación de nitrógeno para su aporte a la planta, interfiriendo con múltiples procesos fisiológicos. En el caso de rizobios capaces de establecer simbiosis con distintas leguminosas, como es el caso de Rhizobium leguminosarum bv viciae con Pisum, Lens, Vicia y Lathyrus, es de esperar que los bacteroides inducidos en cada planta encuentren un hábitat intracelular distinto si cada planta aporta un complemento de péptidos diferente. En esas condiciones el estudio de la respuesta de la bacteria a cada uno de esos hábitats podría aportar información relevante sobre los caracteres que permiten la adaptación de Rhizobium al estilo de vida intracelular en los nódulos de las leguminosas. En este trabajo se trata de evaluar la importancia de caracteres de adaptación al hospedador en la asociación simbiótica entre Rhizobium leguminosarum bv viciae (Rlv) y plantas leguminosas. Para ello se ha realizado la comparación de los perfiles proteómicos de células endosimbióticas de Rlv UPM791 inducidas en nódulos de lenteja (Lens culinaris) y guisante (Pisum sativum). Dichos perfiles se obtuvieron mediante análisis LC-MS de extractos de bacteroides, complementado con marcaje diferencial empleando la metodología iTRAQ. Este análisis ha revelado la existencia de diferencias en la expresión de un número significativo de proteínas codificadas en distintas partes del genoma bacteriano. Entre estas proteínas se han identificado proteínas de respuesta a estrés, un regulador transcripcional de tipo GntR, y otras proteínas que podrían tener un papel en el metabolismo de C/N en el bacteroide. Estos datos sugieren que las bacterias encuentran ambientes distintos en distintos hospedadores induciendo respuestas de adaptación diferenciales. Dos de las proteínas identificadas, denominadas DABA y AMYDO, se encuentran codificadas en el plásmido simbiótico de la bacteri

Functional characterization of Rhizobium leguminosarum bv. viciae DmeRF, a cation diffusion facilitator system involved in nickel and cobalt resistance

In prokaryotes, nickel is an essential element participating in the structure of enzymes involved in multiple cellular processes. Nickel transport is a challenge for microorganisms since, although essential, high levels of this metal inside the cell are toxic. For this reason, bacteria have developed high-affinity nickel transporters as well as nickel-specific detoxification systems. Ultramafic soils, and soils contaminated with heavy metals are excellent sources of nickel resistant bacteria. Molecular analysis of strains isolated in the habitats has revealed novel genetic systems involved in adaptation to such hostile conditions

Identificación y análisis funcional de genes implicados en la homeostasis de níquel en la bacteria endosimbiótica de leguminosas Rhizobium leguminosarum

La asociación Rhizobium-leguminosa constituye una interacción planta-microorganismo particularmente beneficiosa a nivel medioambiental debido a su capacidad promotora del crecimiento vegetal en condiciones de deficiencia de nitrógeno. Se ha demostrado que una excesiva concentración de metales pesados en el suelo afecta negativamente la competitividad bacteriana y al desarrollo de interacciones diazotróficas eficientes (Chaudri et al., 2000; Pereira et al., 2006). Por otro lado, el suministro de metales como Fe, Mo, Ni o Cu es fundamental para la biosíntesis de enzimas bacterianas relacionadas con el proceso de fijación de nitrógeno que ocurre en el interior de los nódulos de las leguminosas (Moreau et al., 1995). Con objeto de identificar sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel en bacterias endosimbióticas, se ha llevado a cabo una mutagénesis mediante inserción aleatoria de un minitransposón derivado de Tn5 en Rhizobium leguminosarum bv. viciae UPM1137, una cepa capaz de resistir elevadas concentraciones de níquel y cobalto. Como resultado de esta mutagénesis se han obtenido 14 mutantes incapaces de crecer en medios suplementados con NiCl2. La localización de la inserción en estos mutantes muestra que una elevada proporción de los genes afectados codifican proteínas de membrana o proteínas secretadas. En paralelo, se ha obtenido la secuencia del genoma de la cepa UPM1137, lo que permite realizar estudios in silico comparando los genomas disponibles de varias cepas de R. leguminosarum bv. viciae, que presentan una menor sensibilidad a metales. El análisis bioinformático de los genomas secuenciados y la caracterización fenotípica de los mutantes obtenidos permitirá identificar potenciales sistemas de resistencia y su contribución a la homeostasis de metales

Analysis of a periplasmic thiol oxidoreductase in Rhizobium leguminosarum

In this work the expression and cellular localization of a predicted periplasmic thiol oxidoreductase encoded by Rhizobium leguminosarum 3841, ORF RL1083, were analysed. Based on the homology of the encoded protein with DsbA proteins from other bacteria we named it dsbA. The genetic organization of dsbA region showed that it is a monocystronic gene. A putative σ70 promoter was predicted upstream dsbA gene. The promoter region fused to gusA reporter gene revealed that dsbA is expressed in free-living conditions in different media and also, although at a lower level, in pea bacteroids. R. leguminosarum DsbA contains a potential Tat-dependent signal peptide. To localize this protein in different cellular fractions the protein was labelled by means of a C-terminal Strep tag. The DsbA-Strep protein was localized in the periplasmic fraction. At present three type of experiments are in progress: first, the study of DsbA Tat-dependence by using a tat mutant strain harbouring dsbA-Strep; second, the construction of a dsbA mutant and third the evaluation of periplasmic disulfide oxidoreductase activity of different strains: wild-type, tat mutant and dsbA mutant

Identification and functional characterization of Rhizobium leguminosarum bv. viciae genetic systems involved in nickel homeostasis.

A collection of Rhizobium leguminosarum bv. viciae strains isolated from ultramafic and contaminated soils in Italy and Germany, respectively, was analyzed for resistance to nickel and cobalt ions. These assays led to the identification of strain UPM1137, which is able to grow at high concentrations of nickel and cobalt. In order to identify genetic systems involved in the homeostasis to these metals, a random mutagenesis was carried out in UPM1137 by inserting a Tn5-derivative minitransposon. As a result 4313 transconjugants were obtained, being 39 of them (0.90%) unable to grow at 1.5 mM NiCl2. The identification of the transposon insertion site in these mutants showed that the disrupted genes encode proteins belonging to different functional categories, where the secreted and membrane proteins were the most numerous. The analysis of heavy metal resistance and phenotypes in symbiotic and free –living cells will define the contribution of these genes to metal homeostasis

Diversity of nickel ligands in nodule cytosol, nickel transport, and expression of a nickel-dependent enzyme in endosymbiotic bacteria as affected by the legume host

Provision of metals to endosymbiotic bacteria represents a potential limitation for metalloenzyme synthesis inside legume nodules. Metal ions are usually bound to organic ligands in the cell cytoplasm, and the nature of such metal-ligand complexes might affect metal availability. We have observed a strong effect of the legume host on hydrogenase synthesis when the same Rhizobium leguminosarum bv. viciae strain establishes a symbiotic interaction with pea (Pisum sativum) or lentil (Lens sculenta) plants. These data, along with the different phenotypes of mutants altered in nickel (Ni) transport in these hosts, suggest a role for the chemical form of Ni on metal provision to the bacteroid. The biochemical analysis of cytosolic fractions of pea and lentil nodules has revealed the different nature and concentration of organic ligands chelating Ni in these host