Identification et caractérisation des cellules tumorales circulantes dans le cancer rénal à cellules claires

La diffusion dans le sang des cellules tumorales circulantes (CTC) à partir de la tumeur primitive est un signe précoce d invasivité tumorale et du risque de développer des métastases. Par conséquent, la capacité à les détecter de façon très sensible et spécifique est censée constituer un test cliniquement important pour le pronostic du cancer, le suivi des patients et la personnalisation de la thérapie. Les CTC sont des cellules rares, et plusieurs méthodes ont été proposées pour leur détection. La technique ISET (Isolation by Size of Epithelial/Tumor cells) se base sur la différence de taille des CTC par rapport aux cellules leucocytaires et a montré une très grande sensibilité d isolement et spécificité d identification des CTC. Elle permet l analyse cytopathologique, immunologique et moléculaire des cellules isolées.Le cancer du rein représente 3% des cancers de l adulte, dans 75% des cas il s agit d un carcinome rénal à cellules claires (RCC). Sur le plan génétique, il est un des rarissimes cancers solides caractérisé par des variations de l ADN, il s agit de mutations au niveau du gène VHL.Ce projet de recherche vise l analyse comparative, moléculaire et cytopathologique, des CTC isolées à partir des patients avec RCC dans le but d évaluer, par une approche moléculaire, les critères cytopathologiques diagnostiques des CTC. Notre étude a porté sur 29 patients ayant bénéficié de l isolement des CTC par ISET avant toute intervention chirurgicale.L analyse cytopathologique a été réalisée utilisant les critères décrits par l équipe de P. Hofman pour définir les CTC (CNHC-MF) et les Cellules Atypiques Circulantes CAC (CNHC-UMF). L analyse génétique par séquençage du gène VHL a été réalisée avec succès sur l ADN de 205 cellules individuelles, sur l ADN issu du tissu tumoral et sur l ADN génomique de chaque patient.Sur les 29 tumeurs étudiées, 25 étaient caractérisées par des mutations du gène VHL. Cent soixante et une cellules, CTC et CAC, isolées à partir du sang de ces 25 patients, ont présenté des variations génétiques du gène VHL identiques à l ADN issu du tissu tumoral. Il s agit de 18 mutations différentes affectant les 3 exons de ce gène. Nous avons trouvé des CTC/CAC dans 29/30 des patients avec CCRC analysés. Des mutations VHL ont été trouvées dans 25 des 29 tumeurs CCRC correspondantes. Nous avons obtenu des résultats spécifiques VHL dans 205 des 327 CTC/CAC microdisséquées, comprenant 64 CTC et 141 CAC, selon l analyse cytopathologique. Les mutations VHL ont été détectées en aveugle dans 57/64 CTC et dans 125/141 CAC. Cependant, nous avons observé que les 8 et 16 CTC et CAC restantes, respectivement, avaient été isolées de patients sans mutations VHL détectables dans le tissu tumoral.Conclusion : Ceci est la première étude comparative de diagnostic génétique et cytopathologique des CTC/CAC chez des patients avec un cancer solide, le CRCC. Nos résultats suggèrent que des critères cytopathologiques élargis pourraient être appliqués au diagnostic des CTC chez les patients avec CCRC. Bien que des études complémentaires et plus élargies soient maintenant nécessaires, cette méthode ouvre la voie à une approche génétique pour le diagnostic des Cellules Tumorales CirculantesDissemination in the circulating tumor cells (CTC) from the primary tumor is an early sign of tumor invasion and risk of metastases. Therefore, the ability to detect CTC through a very sensitive and specific test is expected to be clinically important for cancer prognosis, patient monitoring and customization of therapy. CTCs are rare cells, and several methods have been proposed for their detection. The ISET technique (Isolation by Size of Epithelial /Tumor cells) is based on the difference in size of CTC as compared to leucocytes and provides high sensitivity of CTC isolation and high specificity of CTC identification. This methods also allows cytopathological, immunological and molecular analyses of the isolated cellsKidney cancer accounts for 3% of adult cancers and is a clear cell renal cell carcinoma (RCC) in 75% of cases. RCC is one of very rare cancers characterized by a DNA mutations. IRCC tumor cells are in fact characterized by by mutations in the VHL gene. This research project aims at a comparative molecular and cytopathological analysis of, CTCs isolated from patients with RCC in order to evaluate, through a molecular approach, the diagnostic criteria used for cytopathological identification of CTC. Our study included 29 patients tested by the ISET technique before surgery.The cytopathological analysis was performed using the criteria described by the group of P. Hofman to define CTC (CNHC-MF) and Circulating Atypical Cells "CAC" (UMF-CNHC). Genetic analysis of the VHL gene was successfully performed by sequencing on DNA from 205 individual cells isolated by ISET, on DNA from tumor tissue and on genomic DNA from each patient. Of the 29 tumors studied, 25 were characterized by mutations in the VHL gene. One hundred and sixty-one cells, CTC and CAC, isolated from the blood of the 25 patients, with the tumor having VHL mutation, showed genetic variations in the VHL gene identical to those found in the DNA from the tumor tissue. We found 18 different mutations affecting the three exons of this gene.We found CTC/CAC in 29/30 analyzed patients with CCRC. VHL mutations were found in the tumor of 25 out of the corresponding 29 CCRC tumors. Among 327 microdissected CTC/CAC, we obtained VHL-specific results in 205 including 64 CTC and 141 CAC, according to the cytopathological analysis. VHL mutations were blindly detected in 57/64 CTC and in 125/141 CAC. However, we then observed that the 8 and 16 residual CTC and CAC, respectively, had been isolated from patients without detectable VHL mutations in the tumor tissue. Conclusion: This is the first study comparing genetic and cytopathological diagnosis of CTC/CAC in patients with a solid cancer, CRCC. Our results suggest that broaden cytopathological criteria could be applied to the diagnosis of CTC in patients with CCRC. Although further and larger studies are now needed, this approach opens the way to a genetic approach for the accurate diagnosis of Circulating Tumor Cells.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF

Mise au point d'une méthode non invasive de diagnostic prénatal par l'analyse génétique des cellules foetales circulantes

Le diagnostic prénatal (DPN) des maladies génétiques est actuellement réalisé par des méthodes invasives conduisant à une perte foetale de 1 à 4 % des cas. Dans le but de réaliser un DPN non invasif, la recherche est impliquée sur des nouvelles méthodes d'obtention des cellules foetales identifiées dans le sang maternel et le mucus cervical au stade précoce de la grossesse. Nous avons utilisé la technique d'isolement des trophoblastes (ISET : Isolation by Size of Epithelial Trophoblastic cells). Notre travail a été axé sur la mise au point du DPN non invasif de la mucoviscidose par ISET. La stratégie moléculaire développée et appliquée à 12 couples à risque pour la mucoviscidose a permis de réaliser un diagnostic correct de tous les cas étudiés. Nous avons également appliqué la méthode ISET aux cellules transcervicales obtenues du canal cervical par le cytobrush. Nous avons montré que cette technique pourrait être appliquée sur les prélèvements cervicaux pour réaliser un DPN non invasif.The prenatal diagnosis (PND) of genetic diseases is carried out by invasive techniques leading to a pregnancy loss going from 1 to 4 % of the cases. Aiming of carrying out a non-invasive PND, the research was directed towards new methods for obtaining fetal cells from maternal blood and cervical mucus at early stage of the pregnancy. We used a technique for trophoblastic cells isolation (ISET : Isolation by Size of Epithelial Trophoblastic cells). Our study was focused on the development of the non-invasive PND of cystic fibrosis (CF) by ISET method. The molecular strategy developed and applied to 12 couples at risk for the CF made it possible to carry out a correct diagnosis of all the studied cases. We also applied the method ISET to the transcervical cells obtained from cervical channel by cytobrush. We showed that this technique could be applied to the cervical samplings to carry out non-invasive PND.PARIS5-BU Méd.Cochin (751142101) / SudocSudocFranceF

MUTAGENESE INSERTIONNELLE LIEE AU VIRUS DE L'HEPATITE B DANS LA CARCINOGENESE HEPATIQUE (DECOUVERTE D'UN NOUVEAU VARIANT DE LA PROTEINE SERCA1 ET UNE NOUVELLE PROTEINE MCM)

ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Validation clinique d'une nouvelle approche "ISET" du diagnostic prénatal non invasif d'Amyotrophie spinale

Notre équipe a développé ISET (Isolation by Size of Epithelial Tumor/Trophoblastic cells), une approche prometteuse et non invasive pour le diagnostic prénatal de SMA. L'étude de validation clinique de la méthode ISET pour le DPN de SMA est réalisée suivant le protocole défini par les statisticiens et méthodologistes du site Necker. L'approche, réalisée complètement en aveugle par rapport à la méthode invasive réalisée parallèlement, a visé 160 diagnostics génétiques de SMA par l'étude de 160 cellules foetales isolées du sang (20 ml, 10-11ème semaine d'aménorrhée) de 16 mères à risque (1/4) d'avoir un enfant atteint de la maladie. Les résultats valident la méthode ISET pour le diagnostic prénatal de SMA et constituent le premier cas de validation complète d'une méthode complètement non invasive de diagnostic prénatal de maladie génétique.A promising non-invasive strategy for prenatal diagnosis of SMA has been proposed using ISET (Isolation by Size of Epithelial Trophoblastic cells). A prospective blinded clinical validation study of the ISET method for SMA was set up in the Necker-Enfants Malades Hospital in Paris according to statistical recommendations. It targeted 160 genetic diagnoses of SMA through the study of 160 fetal cells obtained from the blood (20 ml) of 16 mothers at risk of having an affected child. The results show the successful validation of the ISET method for prenatal diagnosis of SMA and should have implications for the implementation of a safe prenatal diagnosis of this genetic disease in clinical practice.PARIS5-BU Méd.Cochin (751142101) / SudocSudocFranceF

Impact de la modulation de la signalisation calcique sur la réplication et l'expression protéïque du virus de l'hépatite C (VHC)

PARIS5-BU Méd.Cochin (751142101) / SudocSudocFranceF

Diagnostic prénatal non-invasif des maladies génétiques par l'étude des cellules fœtales circulant dans le sang maternel (revue de la bibliographie)

PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

HCV-RNA GENOMES PERSIST AND REPLICATE IN HEPATOCELLULAR CARCINOMAS WITHOUT THE PRETUMORAL STEP OF CIRRHOSIS

Chronic infection with hepatitis C virus (HCV) is regarded as a risk factor for hepatocellular cancer, mostly in patients with liver cirrhosis. We looked for HCV genomes in the livers of patients with hepatocellular cancer who did not have cirrhosis to see whether HCV was directly oncogenic. Cancerous and non-cancerous liver tissue, and serum samples from 19 patients negative for hepatitis B surface antigen were analysed by polymerase chain reaction for the presence of HCV genome, HCV replication, HCV genotyping, and HBV genome. 13 of 19 patients were HCV RNA-positive in cancerous and non-cancerous liver tissue; 8 of 17 tested were anti-HCV positive. Among the 13 HCV RNA-positive patients, 11 had genotype 1b and 2 had genotype 2a. 7 of 13 serum samples were HCV RNA positive. 7 of 19 patients were HBV DNA positive in cancerous and non-cancerous liver tissue, 5 of them anti-HBc positive. 4 patients were both HCV RNA and HBV DNA positive and 3 were both HCV RNA and HBV DNA negative. Our results provide evidence for the association of HCV, mostly genotype 1b, with hepatocellular cancer without the intermediate step of cirrhosis