Implication des céramides dans l'atrophie musculaire

Le muscle squelettique fait preuve d'une remarquable plasticité en réponse aux changements physiologiques, comme l activité physique, et aux situations pathologiques. Il subit notamment une atrophie sévère lors de la cachexie qui accompagne diverses pathologies chroniques comme le cancer, le SIDA, etc. L atrophie musculaire est aussiune composante de la sarcopénie qui survient lors du vieillissement normal, et se caractérise par un déclin de la force et de la masse musculaire. L'atrophie musculaire, qui entraîne une augmentation de la mortalité et diminue l efficacité des traitements, constitue donc un problème de santé majeur.La fonte musculaire se caractérise par une altération de l équilibre entre synthèse et dégradation protéiques dans les fibres adultes. Des taux particulièrement élevés de cytokines circulantes, dont le TNFa, qui affectent l homéostasie du muscle via différentes voies de signalisation, semblent être à l origine de l'atrophie. Les mécanismes de la réponse atrophique musculaire à ces taux circulants élevés sont cependant mal définis. Le TNFa a des effets complexes. Il peut activer de multiples voies de signalisation, parmi lesquelles l'induction de la synthèse de sphingolipides, et plus particulièrement de céramides, par la voie de novo et par l'activation des sphingomyélinases. Au niveau musculaire, les céramides sont connus pour leurs effets sur la signalisation de l'insuline, sur l'apoptose et sur la différenciation myogénique. Par contre, leur implication dans le cadre de l'atrophie n'avait jamais été prise en compte. L objectif de ce travail a été dans un premier temps de démontrer le rôle des céramides dans l atrophie. Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé la voie de signalisation par laquelle l augmentation intramusculaire de céramide induite par le TNFa aboutit à une chute de la synthèse protéique, couplée à une augmentation de la protéolyse. Dans ce but, nous avons mis au point des modèles in vitro d'atrophie, impliquant des myotubes traités par des concentrations physiologiques de TNF . Nous avons en parallèle étudié un modèle in vivo de cachexie induite chez la souris par l'implantation d un adénocarcinome C26. L analyse des sphingolipides nous a permis de montrer l augmentation des taux de céramides concomitante à l atrophie générée in vitro et in vivo. Le rôle des céramides dans l atrophie a été démontré par l effet protecteur des inhibiteurs de leur synthèse, dans les modèles in vitro et in vivo. Nous montrons de plus dans un modèle in vitro que les effets atrophiques des céramides sont dus à l inhibition de la voie de signalisation Phospholipase D/mTOR/Akt. Nos résultats nous ont permis de prouver le rôle des sphingolipides dans le contrôle de l homéostasie protéique du muscle. La modulation du métabolisme des sphingolipides apparaît donc comme une nouvelle cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de la perte musculaire associée à diverses pathologies.Skeletal muscle demonstrated a remarkable plasticity in response to physiological changes, such as physical activity, and pathological situations. He suffered such severe atrophy during cachexia that accompanies various pathologies such as cancer, AIDS, etc.. Muscle atrophy is also a component of sarcopenia that occurs during normal aging, and is characterized by a decline in strength and muscle mass. Muscle atrophy, which leads to increased mortality and decreased treatment efficacy, thus constitutes a health problem majeur.La muscle wasting is characterized by an impaired balance between protein synthesis and degradation in adult fibers. Particularly high levels of circulating cytokines, including TNF, which affect muscle homeostasis via different signaling pathways appear to be the cause of atrophy. Mechanisms of muscle atrophy response to these elevated circulating levels are however unclear. TNFa has complex effects. It may activate multiple signaling pathways, including the induction of the synthesis of sphingolipids, especially ceramides, for the de novo pathway and the activation of sphingomyelinases. In muscle, ceramides are known for their effects on insulin signaling on apoptosis and myogenic differentiation. By cons, their involvement in the context of atrophy was never taken into account. The objective of this work was firstly to demonstrate the role of ceramides in atrophy. In a second step, we characterized the signaling pathway by which increased intramuscular ceramide induced by TNF leads to a fall in protein synthesis, coupled with an increase in proteolysis. For this purpose, we have developed in vitro models of atrophy involving myotubes treated with physiological concentrations of TNF . We studied in parallel an in vivo model of cachexia induced in mice by implantation of adenocarcinoma C26. Analysis of sphingolipids we showed increased levels of ceramide concomitant atrophy generated in vitro and in vivo. The role of ceramide in atrophy has been demonstrated by the protective effect of inhibitors of their synthesis in the in vitro and in vivo. We show further in an in vitro model that atrophic effects of ceramides are due to inhibition of phospholipase D signaling pathway / mTOR / Akt. Our results allowed us to prove the role of sphingolipids in the homeostatic control of muscle protein. Modulation of sphingolipid metabolism appears to be a promising new therapeutic target in the treatment of muscle wasting associated with various pathologies.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocVILLEURBANNE-DOC'INSA-Bib. elec. 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Role des sphingolipides dans l'atrophie du muscle

Les sphingolipides sont une famille de lipides membranaires dotés d'un rôle structural, influant sur les propriétés de la bicouche lipidique, mais ils agissent aussi comme des molécules effectrices au rôle essentiel dans de nombreux aspects de la biologie cellulaire. Les sphingolipides céramide, sphingosine et S1P ont des effets opposés: le céramide et la sphingosine inhibent la prolifération et promeuvent la réponse apoptotique à différents stimulus de stress, la S1P est un stimulateur de la prolifération et de la survie cellulaires. Le céramide peut être produit par la voie de synthèse de novo, et l'hydrolyse de la sphingomyéline membranaire catalysée par les sphingomyélinases. Ces deux voies peuvent être activées par la cytokine pro-inflammatoire TNFa, capable d induire une perte musculaire et jouant un rôle crucial dans le développement de la cachexie. Nous avons fait l'hypothèse que le céramide, ou un de ses métabolites, peuvent être des médiateurs de la perte musculaire tumeur-induite. Nous avons examiné le rôle du céramide dans l'atrophie induite in vitro par le TNFa chez les myotubes, en utilisant des analogues de céramide et des inhibiteurs du métabolisme sphingolipidique. L'apport de céramides exogènes est capable de reproduire l'effet atrophique du TNFa, ce qui suggère que le céramide peut participer à l'atrophie musculaire. Pour vérifier si les céramides sont les médiateurs de l'atrophie induite par le TNFa, nous avons analysé l'effet d'inhibiteurs ciblant différentes étapes du métabolisme: l'inhibition de la voie de synthèse de novo est incapable de rétablir la taille des myotubes en présence de TNFa, alors que les inhibiteurs de sphingomyélinase neutre suppriment l'atrophie TNFa-induite. L accumulation de céramide et de sphingosine augmente l effet pro-atrophique, tandis que la S1P a un effet protecteur. Ces observations montrent que, dans les myotubes, le céramide, ou un métabolite produits par la voie de la sphingomyélinase neutre en réponse à une stimulation par le TNFa, participent à l'atrophie des cellules. Pour évaluer le rôle in vivo des sphingolipides, nous avons traité la souris BalbC porteuse d un carcinome C26 avec myriocine, inhibiteur de la synthèse de novo, capable d'induire une déplétion du muscle en sphingolipides, Ce traitement protège partiellement les souris contre la perte de poids corporel et de poids des muscles induite par la tumeur, sans affecter la taille de celle-ci. De plus, la myriocine réverse significativement la perte de taille des fibres musculaires et réduit l'expression des atrogenes, ce qui montre qu'elle protège le muscle contre l'atrophie. Ces résultats suggèrent fortement que le céramide, ou un métabolite sphingolipidique en aval, est impliqué dans l'atrophie musculaire tumeur-induite. La voie des sphingolipides apparaît donc comme une nouvelle cible potentielle d'interventions pharmacologiques visant à protéger le tissu musculaire contre l'atrophie.The sphingolipids are a family of membrane lipids with only a structural role, influencing lipid bilayer properties, but they also act as effector molecules with essential roles in many aspects of cell biology. The sphingolipids ceramide, sphingosine and S1P have shown opposite effects: whereas ceramide and sphingosine usually inhibit proliferation and promote apoptotic responses to different stress stimuli, S1P is known to stimulate cell growth, and promote cell survival. Ceramide can be produced through the de novo synthesis pathway, and by membrane sphingomyelin hydrolysis catalyzed by sphingomyelinases. Both pathways can be activated by the pro-inflammatory cytokine TNFa. Because this cytokine has been shown to promote muscle loss and seems to be crucial in the development of cachexia, we hypothesized that the formation of ceramide, or a metabolite, can be involved in tumor-induced muscle wasting. We investigated the role of ceramide in the in vitro atrophic effects of TNFa on differentiated C2C12 myotubes, by using cell permeant ceramides and inhibitors of sphingolipid metabolism. We observed that TNFa atrophic effects, as evaluated by the reduction in myotube area, are mimicked by exogenous ceramides, supporting the idea that ceramide can participate in muscle atrophy. To verify if ceramide is a mediator of TNFa-induced atrophy, and to identify the metabolites potentially involved, we analyzed the effects of drugs able to block sphingolipid metabolism at different steps: the inhibition of de novo synthesis pathway was unable to restore myotube size in the presence of TNFa whereas the inhibitors of neutral sphingomyelinases reversed TNFa-induced atrophy. Moreover, an accumulation of ceramide and sphingosine induced pro-atrophic effects, whereas sphingosine-1-phosphate had a protective effect. These observations establish that in C2C12 myotubes, ceramide or other downstream metabolites such as sphingosine, produced by the neutral sphingomyelinase pathway in response to TNFa stimulation, participate in cell atrophy. To evaluate the in vivo role of sphingolipids, we treated BalbC mice carrying C26 adenocarcinoma woth Myriocin, an inhibitor of the de novo pathway of ceramide synthesis, that is able to deplete muscle tissue in all sphingolipids, was administered daily to the animals. This treatment partially protected animals against tumor-induced loss of body weight and muscle weight, without affecting the size of tumors. Moreover, myriocin treatment significantly reversed the decrease in myofiber size associated with tumor development, and reduced the expression of atrogenes Foxo3 and Atrogin-1, showing that it was able to protect against muscle atrophy. These results strongly suggest that ceramide, or a downstream sphingolipid metabolite, is involved in tumor-induced muscle atrophy. The sphingolipid pathway thus appears as a new potential target of pharmacological interventions aiming at protecting muscle tissue against atrophy.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocVILLEURBANNE-DOC'INSA-Bib. elec. (692669901) / SudocSudocFranceF

REGULATION DE L'ISOFORME D'AMPC-PHOSPHODIESTERASE PDE4D3 PAR FIXATION DE L'ACIDE PHOSPHATIDIQUE ; LOCALISATION D'UN SITE SPECIFIQUE DE LIAISON ET CONSEQUENCES POUR LA SIGNALISATION CELLULAIRE DEPENDANTE DE L'AMPC

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La Phospholipase D, une voie de signalisation lipidique impliquée dans de multiples fonctions cellulaires (morphologie, prolifération, différenciation)

La phospholipase D (PLD), qui hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes cellulaires et donne naissance à un médiateur phospholipidique, l'acide phosphatidique, joue un rôle central dans diverses fonctions cellulaires. Nous avons tout d'abord mis en évidence l'implication des céramides dans la différenciation des myoblastes de rat L6. Ces cellules sont capables de se différencier in vitro en myotubes polynucléés exprimant divers marqueurs du tissu musculaire, en présence de vasopressine. Cette hormone induit une régulation biphasique des taux cellulaires de céramides, avec une décroissance dans les premières heures, suivie d'une augmentation jusqu'au 8e jour, attribuable à l'activation de la voie de biosynthèse de novo. Les céramides ainsi formés ont un effet régulateur négatif sur la différenciation, au moins en partie à cause du contrôle négatif qu'ils exercent sur l'expression de l'isoforme PLD1, dont nous avions démontré le caractère indispensable à la myogénèse. Nous avons de plus observé que les céramides inhibent le réorganisation PLD1- dépendante du cytosquelette d'actine, une des premières étapes du processus myogénique. La régulation de la PLD par les céramides semble constituer une cible pharmacologique intéressante pour des actions visant à favoriser la régénération musculaire dans diverses situations pathologiques. Par ailleurs, nous avons montré que la PLD intervient dans le contrôle de la perméabilité paracellulaire d'une monocouche de cellules endothéliales HUV-EC-C aux macromolécules, grâce à ses effets sur le cytosquelette d'actine. Les lipoprotéines de faible densité (LDL), natives ou oxydées, mises en contact avec la monocouche, sont capables de stimuler l'activité PLD des cellules et la perméabilité aux macromolécules. Elles provoquent en parallèle un remodelage PLD-dépendant du cytosquelette avec la formation de fibres de stress, et un changement de morphologie cellulaire. Les LDL stimulent donc leur propre passage transendothélial, via leur capacité à réguler la PLD. Un défaut de régulation de la PLD pourrait contribuer à une accumulation subendothéliale anormale des LDL, et, étant donné le rôle proathérogène de ces molécules, à l'accélération du processus athéroscléreux. Des travaux antérieurs avaient établi la présence de l'isoforme PLD1 au niveau des radeaux lipidiques membranaires de lymphocytes périphériques humains, et suggéré un lien entre la délocalisation de l'enzyme, son activation, et une inhibition de la réponse aux mitogènes. Nous avons confirmé que la perturbation des radeaux, par des agents agissant spécifiquement sur les lipides de ce compartiment, est associée à une activation de la PLD et à une inhibition de la prolifération lymphocytaire. Par des expériences de surexpression, nous avons montré que l'isoforme PLD1, mas pas l'isoforme PLD2, est spécifiquement responsable d'un contrôle négatif de l'activation lymphocytaire. La mise en évidence de la régulation de PLD1 par inclusion / exclusion du compartiment radeaux lipidiques, et la démonstration de son implication dans le contrôle de la réponse lymphocytaire, devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans diverses pathologies de l'immunité.Phospholipase D (PLD) hydrolyses phosphatidylcholine of cell membranes in response to a variety of agonists, to generate phosphatidic acid, a second messenger implicated in cell functions such as cytoskeletal reorganization. In L6 skeletal myoblasts induced to differentiate, a short-lived lowering of ceramide levels was followed by a long-lasting elevation due to de novo synthesis. Ceramide mediates a negative control of myogenic differentiation, at least in part through down-regulation of PLD1 isoform expression and inhibition of PLD1-dependent formation of stress fibers. Moreover, we show that PLD is involved in paracellular permeability of endothelial cells through actin cytoskeleton reorganization, and morphological changes. In addition, we show that disruption of membrane lipid rafts by agents specifically active on the lipids of this compartment, induces an activation of PLD and generates anti-proliferative signals in lymphocytes.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocSudocFranceF

La Phospholipase D, une voie de signalisation lipidique impliquée dans de multiples fonctions cellulaires (morphologie, prolifération, différenciation)

La phospholipase D (PLD), qui hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes cellulaires et donne naissance à un médiateur phospholipidique, l'acide phosphatidique, joue un rôle central dans diverses fonctions cellulaires. Nous avons tout d'abord mis en évidence l'implication des céramides dans la différenciation des myoblastes de rat L6. Ces cellules sont capables de se différencier in vitro en myotubes polynucléés exprimant divers marqueurs du tissu musculaire, en présence de vasopressine. Cette hormone induit une régulation biphasique des taux cellulaires de céramides, avec une décroissance dans les premières heures, suivie d'une augmentation jusqu'au 8e jour, attribuable à l'activation de la voie de biosynthèse de novo. Les céramides ainsi formés ont un effet régulateur négatif sur la différenciation, au moins en partie à cause du contrôle négatif qu'ils exercent sur l'expression de l'isoforme PLD1, dont nous avions démontré le caractère indispensable à la myogénèse. Nous avons de plus observé que les céramides inhibent le réorganisation PLD1- dépendante du cytosquelette d'actine, une des premières étapes du processus myogénique. La régulation de la PLD par les céramides semble constituer une cible pharmacologique intéressante pour des actions visant à favoriser la régénération musculaire dans diverses situations pathologiques. Par ailleurs, nous avons montré que la PLD intervient dans le contrôle de la perméabilité paracellulaire d'une monocouche de cellules endothéliales HUV-EC-C aux macromolécules, grâce à ses effets sur le cytosquelette d'actine. Les lipoprotéines de faible densité (LDL), natives ou oxydées, mises en contact avec la monocouche, sont capables de stimuler l'activité PLD des cellules et la perméabilité aux macromolécules. Elles provoquent en parallèle un remodelage PLD-dépendant du cytosquelette avec la formation de fibres de stress, et un changement de morphologie cellulaire. Les LDL stimulent donc leur propre passage transendothélial, via leur capacité à réguler la PLD. Un défaut de régulation de la PLD pourrait contribuer à une accumulation subendothéliale anormale des LDL, et, étant donné le rôle proathérogène de ces molécules, à l'accélération du processus athéroscléreux. Des travaux antérieurs avaient établi la présence de l'isoforme PLD1 au niveau des radeaux lipidiques membranaires de lymphocytes périphériques humains, et suggéré un lien entre la délocalisation de l'enzyme, son activation, et une inhibition de la réponse aux mitogènes. Nous avons confirmé que la perturbation des radeaux, par des agents agissant spécifiquement sur les lipides de ce compartiment, est associée à une activation de la PLD et à une inhibition de la prolifération lymphocytaire. Par des expériences de surexpression, nous avons montré que l'isoforme PLD1, mas pas l'isoforme PLD2, est spécifiquement responsable d'un contrôle négatif de l'activation lymphocytaire. La mise en évidence de la régulation de PLD1 par inclusion / exclusion du compartiment radeaux lipidiques, et la démonstration de son implication dans le contrôle de la réponse lymphocytaire, devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans diverses pathologies de l'immunité.Phospholipase D (PLD) hydrolyses phosphatidylcholine of cell membranes in response to a variety of agonists, to generate phosphatidic acid, a second messenger implicated in cell functions such as cytoskeletal reorganization. In L6 skeletal myoblasts induced to differentiate, a short-lived lowering of ceramide levels was followed by a long-lasting elevation due to de novo synthesis. Ceramide mediates a negative control of myogenic differentiation, at least in part through down-regulation of PLD1 isoform expression and inhibition of PLD1-dependent formation of stress fibers. Moreover, we show that PLD is involved in paracellular permeability of endothelial cells through actin cytoskeleton reorganization, and morphological changes. In addition, we show that disruption of membrane lipid rafts by agents specifically active on the lipids of this compartment, induces an activation of PLD and generates anti-proliferative signals in lymphocytes.VILLEURBANNE-DOC'INSA LYON (692662301) / SudocSudocFranceF

Myogenic differentiation and lipid-raft composition of L6 skeletal muscle cells are modulated by PUFAs.

International audienceLipid composition and fatty acid analysis of the major classes of membrane phospholipids were determined during myogenic differentiation of L6 skeletal muscle cells. The cholesterol to glycerophospholipids ratio decreased during differentiation, both in total (TM) and detergent-resistant membranes (DRM). Analyses of the membrane lipids showed that differentiation had a major impact on the molecular composition of glycerophospholipids. A significant decrease in the concentration of saturated fatty acids was detected in glycerophospholipid classes, and to a lesser extent in sphingolipids, while the concentration of 16:1n-7, 18:1n-7 and 18:1n-9 increased. At the same time, the concentration of long polyunsaturated fatty acid chains decreased in TM and DRM glycerophospholipids, resulting in a lower saturated to unsaturated fatty acid ratio in myotubes as compared to myoblasts. Interestingly, the observed n-3/n-6 ratio was lower in differentiated cell membranes. PUFA supplementation of L6 cells led to an increase in myogenic differentiation correlated to an incorporation of added PUFAs in TM and DRM glycerophospholipids. As expected after n-3 PUFA supplementation, the n-3/n-6 ratio was clearly increased in TM and, surprisingly, this was also the case in isolated DRM. n-3 and n-6 PUFAs significantly and time-dependently increased the phosphorylation of kinase p70S6K1 during myogenic differentiation, revealing the activation of the upstream kinase mTORC1, a major regulator of cell cycle and protein translation. In contrast, PUFAs did not affect the phosphorylation of the kinase Akt, another pivotal regulator of cell metabolism. These results suggest that PUFA supplementation modified the membrane lipid composition and affected the differentiation of L6 cells

Phorbol ester-induced differentiation of L6 myogenic cells involves phospholipase D activation

TPA, a potent PKC activator, inhibits myogenic differentiation and activates phospholipase D (PLD). We evaluated the involvement of PLD in the TPA effects on L6 myoblasts differentiation. TPA, at concentrations inhibiting differentiation of L6 cells, induced a strong, though transient, PLD activation. Surprisingly, at nanomolar concentration, TPA induced both myogenic differentiation and sustained activation of PLD. Differential effect of TPA can be ascribed to PKC downregulation induced by highest TPA concentrations. TPA-induced differentiation was inhibited by 1-butanol, confirming the involvement of PLD in this effect. These data suggest that prolonged elevation of PLD activity is required for myogenic differentiation. (C) 2004 Published by Elsevier B.V. on behalf of the Federation of European Biochemical Societies