The role of PPARβ/δ in human macrophages

Macrophages represent the most diverse cell type in biology. They adapt selectively to many stimuli allowing for precise functionality in any environment without harming the organism. Consequently, they monitor their surroundings carefully and react to a plethora of signals. Fatty acids and their derivatives are important signaling mediators in this context, which besides other signals impinge on the lipid-regulated nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor (PPARβ/δ). Studies conducted in mice have shown that ablation of PPARβ/δ results in the inability of adipose and liver macrophages to adopt an alternative anti-inflammatory activation state, demonstrating a prominent role of PPARβ/δ in macrophage function with implications for immune regulation. To date, however, systematic studies focusing on PPARβ/δ's role in human macrophages have not been reported. The first part of this thesis addresses the role of PPARβ/δ in human macrophages including its transcriptional network affecting a multitude of cellular processes. A major part of this network involves cell type independent canonical regulation, which is characterized by the binding of PPARβ/δ with its obligatory dimerization partner retinoid X receptor (RXR) to specific sites in the regulatory region of established and previously unreported target genes, their induction by agonists and repression by inverse agonists. Additionally, a new set of non-canonical regulated target genes is described. These genes lack chromatin-bound PPARβ/δ complexes, are repressed by agonists (inverse regulation) and are macrophage-selective. Consistent with the prevailing opinion and the induction of an IL4-like morphological phenotype by agonists, this mode of regulation inhibits pro-inflammatory signaling. Surprisingly, anti-inflammatory genes, such as CD32B, IDO1 and CD274 (PD-L1) were also repressed. Consistent with these results, immune functions such as CD8+ T cell activation were stimulated by these ligands. In combination, these findings point to a unique macrophage activation state induced by PPARβ/δ agonists with context dependent functions in immune regulation. The second part describes the PPARβ/δ-regulated transcriptome for tumor-associated macrophages (TAMs) from human serous ovarian carcinoma ascites. Interestingly, most canonical PPARβ/δ target genes were found to be upregulated and refractory to synthetic agonists as compared to monocyte-derived macrophages. This was not due to a TAM specific increase in PPARβ/δ protein level or recruitment to target genes. However, the unaffected response of these genes to inverse agonists hinted at the presence of endogenous activating ligands. Lipidomic analysis of malignancy-associated ascites indeed revealed very high concentrations of dietary polyunsaturated fatty acids (PUFAs), mainly linoleic and arachidonic acid. These PUFAs induced lipid droplet formation in macrophages which provide a potential reservoir for PPARβ/δ agonists and may serve as the causal nexus for target gene deregulation. Among the deregulated genes, ANGPTL4 is associated with shorter relapse-free survival, illustrating the potential clinical implications of these finding

Transkriptionsregulation der Pyruvatdehydrogenase-Kinase 4 (PDK4), einem zentralen Schalter des Glukosestoffwechsels, durch Zelladhäsion und onkogene Signalwege beim humanen Ovarialkarzinom

Das Ovarialkarzinom ist die gynäkologische Krebserkrankung mit der höchsten Letalität, was vor allem durch die passive Metastasierung über den Peritonealraum bedingt ist. Dabei breiten sich Tumorzellen als Einzelzellen oder mehrzellige Sphäroide über die Peritonealflüssigkeit aus, um an anderer Stelle Metastasen auszubilden. Der damit einhergehende Adhärenzverlust dieser Zellen ist demnach von großer klinischer Relevanz und bedarf weiterer funktioneller Analysen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit PDK4 erstmals ein Gen in primären humanen Ovarialkarzinomzellen und in der Modellzelllinie SKOV-3 identifiziert werden, dessen Expression stark von Adhärenz und Adhärenzverlust beeinflusst wird. Die mit dem Adhärenzverlust einhergehende Induktion scheint mit dem glykolytischen Metabolismus dieser Zellen funktionell in Verbindung zu stehen, im Einklang mit der zentralen Rolle von PDKs als negative Regulatoren der Pyruvatdehydrogenase und somit der Energiegewinnung aus Glukose durch oxidative Phosphorylierung. Eine detaillierte Untersuchung der adhärenzvermittelten PDK4-Regulation zeigte, dass Interaktionen zwischen Komponenten der Extrazellulärmatrix und Integrinen dafür verantwortlich sind. Der weitere Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der detaillierten mechanistischen Aufklärung dieser transkriptionellen Kontrolle und die damit verbundene Identifizierung der verantwortlichen Signalwege anhand der Modellzelllinie SKOV-3. Hierzu wurde nach pharmakologischer Modulation bestimmter Signalwege oder einer RNAi-vermittelten Inhibition spezifischer Signalproteine die Phosphorylierung kritischer Signalkomponenten, Chromatinbindung und Regulation von PDK4 untersucht. Die hierbei erzielten Ergebnisse deuten auf eine Kooperation mehrerer Signalwege bei der Regulation des PDK4-Gens durch Adhärenzverlust hin. Hierzu zählen der SRC-PI3K-AKT-Signalweg, die GSK3-β-Catenin-Signalkaskade, der Estrogenrezeptor, der Transkriptionsfaktor C/EBPβ und Umstrukturierungen des Aktinzytoskeletts. Über die adhärenzvermittelte PDK4-Regulation hinaus liefern die Ergebnisse dieser Arbeit ein Bild zur Transkriptionsregulation des PDK4-Gens durch tumorbiologisch relevante Signale im humanen Ovarialkarzinom. So führen die Aktivierung des Adenylylcyclase-cAMP-PKA-Signalwegs, die Inhibition des SRC-PI3K-AKT-Signalwegs sowie Estrogen, Glukokortikoid und Zell-Zell-Kontakte zu einer Induktion der PDK4-Expression. Die komplexe Regulation von PDK4, insbesondere auch durch onkogene Signalwege, und die zentrale Funktion im Glukosemetabolismus unterstreichen die essentielle Rolle von PDK4 im Tumormetabolismus und weisen auf PDK4 als mögliches therapeutisches Ziel bei der Behandlung des Ovarialkarzinoms hin

Analyse von Zytokinen im Aszites des Ovarialkarzinoms und Assoziationen mit der klinischen Progression

Das Ovarialkarzinom ist das dritthäufigste gynäkologische Malignom in der westlichen Welt, weist jedoch die höchste Mortalität unter ihnen auf. Als „stummes“ Karzinom wird das Ovarialkarzinom zumeist erst in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert. Dann liegt meist bereits eine Metastasierung in die gesamte Bauchhöhle mit Ausbildung von Aszites als Folge der Peritonealkarzinose vor. Um einen Anhalt für die Bedeutung einzelner Zytokine bzw. dem Tumormarker CA-125 (im Folgenden unter Zytokine gefasst) im malignen Aszites zu erhalten, wurden deren Konzentrationen in Proben des malignen Aszites von 31 Patientinnen bestimmt und anschließend sowohl untereinander korreliert als auch mit dem rezidivfreien Überleben assoziiert. Signifikante Unterschiede in der rezidivfreien Überlebenszeit der Patientinnen zwischen den als „niedrig“ bzw. „hoch“ gruppierten Zytokinwerten ergaben sich für folgende Zytokine: CA-125 (***p=0,005), IL-6 (*p=0,01), IL-10 (****p<0,0001), LIF (*p=0,0162), S100 A8 (*p=0,0225) und TGF- β (*p=0,0378). In diesen Fällen waren hohe Zytokinspiegel mit einem kürzeren rezidifreien Überleben assoziiert. Bei der Berechnung des medianen rezidivfreien Überlebens ergaben sich entsprechend signifikante Unterschiede im Falle von CA-125 (27 vs 13 Monate), IL-6 (27 vs 13,5 Monate), IL-10 (26 vs 12 Monate), LIF (26 vs 13 Monate), S100 A8 (23 vs 12,5 Monate) und TGF- β (27 vs 15 Monate). Auch hier sind hohe Zytokinspiegel mit einem signifikant kürzeren medianen rezidivfreien Überleben assoziiert. Zusätzlich erwiesen sich diese Zytokine als untereinander prädiktiv. Es zeigte sich eine sehr starke Korrelationen zwischen IL-6 und LIF (r=0,802; ***p<0,001), beides STAT3-aktivierende Zytokine. Des Weiteren zeigte sich eine sehr starke Korrelation zwischen M-CSF und CA-125 (r=0,783; ***p<0,001), beide werden sezerniert von Tumorzellen, was einen möglichen Hinweis auf die Tumorlast geben könnte. Dass S100A8 und ANGPTL-4 eventuell beide Zielgene von TGF-β sind, zeigt sich in den starken Korrelationen zwischen S100A8 und TGF-β (r=0,628; ***p<0,001) und ANGPTL-4 und TGF-β (r=0,593; ***p<0,001). Eine moderate Korrelation zeigte sich zwischen IL-6 und IL-10 (r=0,385; *p<0,05), beides STAT 3-aktivierende Zytokine. Die Korrelation der Zytokinspiegel mit dem BMI zeigte nur für Leptin signifikante Werte (r=0,655; **p<0,005). Bei Experimenten mit Ovarialkarzinomzelllinien konnte ein pro-proliferativer Effekt von Leptin beobachtet werden. Die Analyse des vermittelnden Signalweges in verschiedenen Ovarialkarzinomzellen und HUVEC konnte entgegen der Ergebnisse der Literatur keine Aktivierung des Signalweges STAT-3 nachweisen, wohingegen eine verstärkte Induktion des MAPK/ERK-Signalweges und des PI3K/AKT-Signalweges beobachtet werden konnte