Caracterização do gene vip3A e toxicidade da proteína Vip3Aa50 à lagarta-do-cartucho e à lagarta-da-soja

O objetivo deste trabalho foi caracterizar o gene vip3A de Bacillus thuringiensis e verificar a toxicidade da proteína Vip3Aa50 a larvas da lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda) e da lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis). O gene vip3A foi amplificado por PCR, com iniciadores específicos, e gerou um fragmento de 2.370 pb. Esse fragmento foi clonado em vetor pGEM-T Easy e, em seguida, sequenciado, subclonado em vetor de expressão pET-28a (+) e inserido em células de Escherichia coli BL21 (DE3). A expressão da proteína Vip3Aa50 foi induzida por isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), visualizada em SDS-PAGE e detectada por "Western blot". Os ensaios de toxicidade revelaram alta atividade da proteína Vip3Aa50 contra as larvas neonatas da lagarta-da-soja e da lagarta-do-cartucho, com CL50 de 20,3 e 79,6 ng cm-2, respectivamente. O gene vip3Aa50 é um novo gene da classe vip3A

Milho BT: alternativa biotecnológica para controle biológico de insetos-praga.

200

Insecticidal activity of culture supernatants from Bacillus thuringiensis Berliner strains against Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera: Noctuidae) larvae.

Recentemente, proteinas inseticidas vegetativas (Vips), identificadas no sobrenadante da cultura de certas cepas de Bacillus thuringiensis (B.t.), foram capazes de controlar alguns insetos-praga economicamente importantes. Como avaliacao do potencial de aplicabilidade destas proteinas contra a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda Smith), o inseto-praga mais importante da cultura do milho, as caracteristicas e o efeito de mortalidade do sobrenadante da cultura de cinco cepas de B.t. foram investigadas. Notaveis diferencas entre as cepas foram detectadas, nao somente em termos de eficiencia na mortalidade dos insetos, mas tambem nas diferencas de mortalidade entre os sobrenadantes aquecido e nao-aquecido tratamentos estes que foram usados para distinguir a fracao proteica inseticida termo-sensivel de outra fracao termo-estavel, de natureza nao-proteica (b-exotoxinas). Os padroes qualitativo , quantitativo e temporal de secrecao da proteina total no meio (sobrenadante) foram avaliados por espectrofotometria e eletroforese em gel de poliacrilamida. As cepas apresentaram distintas taxas de crescimento e tempos de secrecao de proteinas em relacao a densidade de celulas na cultura. Alem disso, o padrao de bandas eletroforeticas tambem variou de maneira cepa-especifica, em ambas condicoes desnaturantes e nao-desnaturantes. Polipeptideos que apresentaram peso molecular semelhantes aos esperados para proteinas Vip3A identificadas anteriormente foram encontradas em cepas com alta taxa de mortalidade do sobrenadante. Os dados sugerem a possibilidade e a utilidade de pesquisar fracoes inseticidas de natureza proteica (do tipo Vip) em sobrenadantes de B.t., como forma para desenvolver alternativas especificas e eficientes de controle biologico que possam ser empregadas em programas de manejo integrado de S. frugiperda em milho tropical.199

Identificação e caracterização de genes vip e cry coleóptero‑específicos em isolados de Bacillus thuringiensis

O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar os genes cry3, vip1, vip2 e vip1/vip2 em uma coleção de 1.078 isolados de Bacillus thuringiensis potencialmente tóxicos para larvas de coleópteros. Foram utilizados pares de oligonucleotídeos iniciadores gerais obtidos a partir de regiões conservadas dos genes e do alinhamento de sequências consenso. Posteriormente, os isolados positivos foram caracterizados por meio da técnica de PCR‑RFLP, tendo-se utilizado enzimas de restrição específicas, para identificar novas subclasses de genes nos isolados. Cento e cinquenta e um isolados foram positivos para os genes avaliados, com maior frequência para o gene vip1/vip2 (139 isolados). Pela técnica de PCR‑RFLP, foram observados 14 perfis polimórficos, o que indica a presença de diferentes alelos e, consequentemente, de distintas subclasses desses genes