Mechanismen der C-Domänen-vermittelten Lipoinitiation in der nichtribosomalen Peptidsynthese

Nichtribosomal synthetisierte Lipopeptide aus mikrobiellen Organismen weisen ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten auf, zu denen beispielsweise antibiotische, antitumorale aber auch biotensidische Eigenschaften zählen. Daher sind diese Naturstoffe von pharmazeutischem sowie biotechnologischem Interesse und stellen einen Gegenstand intensiver gegenwärtiger Forschung dar. Die Biosynthese dieser Lipopeptide beginnt in der Regel mit der Inkorporation des Fettsäurerestes, die durch eine N-Acylierung des Peptidrückgrats stattfindet und als Lipoinitiation bezeichnet wird. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung verschiedener Lipoinitiationsmechanismen, zu denen die Aktivierung und die Übertragung des Fettsäurerests gehört. In den Biosynthesewegen des Lipoheptapeptids Surfactin aus Bacillus subtilis und des sauren Lipodepsipeptids CDA (engl.: calcium-dependent antibiotic) aus Streptomyces coelicolor A3(2) konnten diese Reaktionen biochemisch charakterisiert werden. Diese stellen zwei neue Strategien der Lipoinitiation dar. Dazu wurden die beteiligten Domänen der nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) heterolog als singuläre Proteine produziert und die Substrate, sofern nötig, chemisch synthetisiert. In den biochemischen Untersuchungen zeigte sich, dass in beiden Reaktionen die Kondensations(C)-Domäne des Initiationsmoduls der jeweiligen Peptidsynthetase als Acyltransferase wirkt und für den Transfer der Fettsäure essentiell ist. Die Notwendigkeit des aus anderen C-Domänen bekannten katalytisch aktiven Motivs HHxxxDG konnte durch Mutationsstudien in den hier untersuchten Initiations-C‑Domänen bestätigt werden und deutet auf einen universellen Katalysemechanismus der Familie der C‑Domänen hin. Die beiden untersuchten Systeme der Lipoinitiation der Surfactin- und CDA-Biosynthese zeigten jedoch auch Unterschiede. Während in der Surfactinsynthese eine durch Enzyme aus dem Primärmetabolismus CoA-aktivierte Fettsäure mit der Peptidyl-Carrier-Protein(PCP)-gebundenen Aminosäure kondensiert wird, wird die Fettsäure in der CDA-Biosynthese von einem Acyl-Carrier-Protein ausgehend übertragen. In beiden Reaktionen zeigten sich ausgeprägte Spezifitäten mit Ausnahme der Selektivität für die PCP‑Domäne, die in beiden Systemen durch fremde PCP-Domänen substituiert werden konnte. Der zweite Teil der Arbeit bestand aus der Charakterisierung der eng mit C-Domänen verwandten Zyklisierungs-Domäne aus der Bacitracin-Synthetase BacA-Cy2. Diese katalysiert die Bildung des Thiazolinrings in dem Antibiotikum Bacitracin aus Bacillus licheniformis und wurde in dieser Arbeit ebenfalls als freistehendes Protein heterolog produziert, wodurch eine genaue Charakterisierung und Bestimmung der ausgeprägten Substratspezifität ermöglicht wurde

Crystal Structure of a PCP/Sfp Complex Reveals the Structural Basis for Carrier Protein Posttranslational Modification

SummaryPhosphopantetheine transferases represent a class of enzymes found throughout all forms of life. From a structural point of view, they are subdivided into three groups, with transferases from group II being the most widespread. They are required for the posttranslational modification of carrier proteins involved in diverse metabolic pathways. We determined the crystal structure of the group II phosphopantetheine transferase Sfp from Bacillus in complex with a substrate carrier protein in the presence of coenzyme A and magnesium, and observed two protein-protein interaction sites. Mutational analysis showed that only the hydrophobic contacts between the carrier protein’s second helix and the C-terminal domain of Sfp are essential for their productive interaction. Comparison with a similar structure of a complex of human proteins suggests that the mode of interaction is highly conserved in all domains of life

Mechanismen der C-Domänen-vermittelten Lipoinitiation in der nichtribosomalen Peptidsynthese

Nichtribosomal synthetisierte Lipopeptide aus mikrobiellen Organismen weisen ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten auf, zu denen beispielsweise antibiotische, antitumorale aber auch biotensidische Eigenschaften zählen. Daher sind diese Naturstoffe von pharmazeutischem sowie biotechnologischem Interesse und stellen einen Gegenstand intensiver gegenwärtiger Forschung dar. Die Biosynthese dieser Lipopeptide beginnt in der Regel mit der Inkorporation des Fettsäurerestes, die durch eine N-Acylierung des Peptidrückgrats stattfindet und als Lipoinitiation bezeichnet wird. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung verschiedener Lipoinitiationsmechanismen, zu denen die Aktivierung und die Übertragung des Fettsäurerests gehört. In den Biosynthesewegen des Lipoheptapeptids Surfactin aus Bacillus subtilis und des sauren Lipodepsipeptids CDA (engl.: calcium-dependent antibiotic) aus Streptomyces coelicolor A3(2) konnten diese Reaktionen biochemisch charakterisiert werden. Diese stellen zwei neue Strategien der Lipoinitiation dar. Dazu wurden die beteiligten Domänen der nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) heterolog als singuläre Proteine produziert und die Substrate, sofern nötig, chemisch synthetisiert. In den biochemischen Untersuchungen zeigte sich, dass in beiden Reaktionen die Kondensations(C)-Domäne des Initiationsmoduls der jeweiligen Peptidsynthetase als Acyltransferase wirkt und für den Transfer der Fettsäure essentiell ist. Die Notwendigkeit des aus anderen C-Domänen bekannten katalytisch aktiven Motivs HHxxxDG konnte durch Mutationsstudien in den hier untersuchten Initiations-C‑Domänen bestätigt werden und deutet auf einen universellen Katalysemechanismus der Familie der C‑Domänen hin. Die beiden untersuchten Systeme der Lipoinitiation der Surfactin- und CDA-Biosynthese zeigten jedoch auch Unterschiede. Während in der Surfactinsynthese eine durch Enzyme aus dem Primärmetabolismus CoA-aktivierte Fettsäure mit der Peptidyl-Carrier-Protein(PCP)-gebundenen Aminosäure kondensiert wird, wird die Fettsäure in der CDA-Biosynthese von einem Acyl-Carrier-Protein ausgehend übertragen. In beiden Reaktionen zeigten sich ausgeprägte Spezifitäten mit Ausnahme der Selektivität für die PCP‑Domäne, die in beiden Systemen durch fremde PCP-Domänen substituiert werden konnte. Der zweite Teil der Arbeit bestand aus der Charakterisierung der eng mit C-Domänen verwandten Zyklisierungs-Domäne aus der Bacitracin-Synthetase BacA-Cy2. Diese katalysiert die Bildung des Thiazolinrings in dem Antibiotikum Bacitracin aus Bacillus licheniformis und wurde in dieser Arbeit ebenfalls als freistehendes Protein heterolog produziert, wodurch eine genaue Charakterisierung und Bestimmung der ausgeprägten Substratspezifität ermöglicht wurde

Structural Characterization of the Heterobactin Siderophores from <i>Rhodococcus erythropolis</i> PR4 and Elucidation of Their Biosynthetic Machinery

In this study, the isolation, the structural characterization, and the elucidation of the biosynthetic origin of heterobactins, catecholate-hydroxamate mixed-type siderophores from <i>Rhodococcus erythropolis</i> PR4, are reported. The structure elucidation of heterobactin A was accomplished via MS^<i>n</i> analysis and NMR spectroscopy and revealed the noteworthy presence of a peptide bond between the guanidine group of an arginine residue and a 2,3-dihydroxybenzoate moiety. The two heterobactin S1 and S2 variants are derivatives of heterobactin A that have sulfonation modifications on the aromatic rings. The bioinformatic analysis of the <i>R. erythropolis</i> PR4 genome and the subsequent genetic and biochemical characterization of the putative biosynthetic machinery identified the gene cluster responsible for the biosynthesis of the heterobactins. Interestingly, the HtbG NRPS presents an unprecedented C-PCP-A domain organization within the second module of the synthetase that may help the correct elongation of the peptide intermediate. Finally, the present work revises the structure of heterobactin A that was described by Carrano et al. in 2001

Isolation, Structure Elucidation, and Biosynthesis of an Unusual Hydroxamic Acid Ester-Containing Siderophore from <i>Actinosynnema mirum</i>

In this study we report the isolation, structure elucidation, and biosynthesis of mirubactin (<b>1</b>), a siderophore containing an unprecedented chemical functionality in natural products, namely, an <i>O</i>-acyl hydroxamic acid ester. Mirubactin represents the first siderophore isolated from the genus <i>Actinosynnema</i> and the first natural product produced by <i>Actinosynnema mirum</i> whose biosynthetic gene cluster could be identified. Structure elucidation was accomplished through a combination of spectroscopic (NMR, IR, and UV/vis) and mass spectrometric methods and revealed the presence of an unusual ester bond between the δ-<i>N</i>-hydroxyl group of δ-<i>N</i>-formyl-δ-<i>N</i>-hydroxyornithine and a 2,3-dihydroxybenzoate moiety. Bioinformatic analysis of the <i>A. mirum</i> genome and subsequent biochemical characterization of the putative biosynthetic machinery identified the gene cluster responsible for mirubactin assembly. The proposed biosynthesis of mirubactin comprises the iterative use of a stand-alone carrier-protein-bound substrate, as well as an ester-bond-forming step catalyzed by a C-terminal condensation domain, thus revealing an interesting system for further biochemical studies to gain a deeper understanding of nonribosomal peptide synthetase-catalyzed siderophore biosynthesis