Polyethylenimine- and lipid- based nanoparticles as gene and drug delivery systems for aerosol therapy to the lung

Inhalt dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung verschiedener polymer- und lipid-basierter nanopartikulärer Formulierungen mit dem Ziel, diese bei der inhalativen Behandlung von Lungenerkrankungen einzusetzen zu können. Eine Reihe von Polyethyleniminen (PEI) wurde auf ihre Verwendbarkeit als nicht-virale biokompatible DNA- Transporter für eine Lungen-Gentherapie untersucht (Kapitel 2-5). Eine weitere Studie (Kapitel 6) verfolgte das Ziel Liposomen zu entwickeln, die für eine kontrollierte Wirkstofffreigabe nach Inhalation geeignet sind. Die Untersuchungen des Kapitels 2 stellen in dieser Dissertation, die Grundlage der Evaluierung von PEI als inhalierbare DNA Transporter zu dienen, dar. Es wurden vier verschiedene PEI-Modifikationen (verzweigtes, lineares, bioabbaubares & Polyethylenglycol-modifiziertes PEI) ausgewählt, die mit plasmidischer DNA (pDNA) Partikel in der Größenordnung von ca. 100 nm formten. Diese so genannten Polyplexe wurden hinsichtlich ihrer strukturellen und physikochemischen Veränderung während der Vernebelung mit einem Düsen- bzw. einem Ultraschallvernebler charakterisiert. Für diese Untersuchungen fanden verschiedene Techniken Anwendung, wie die Rasterkraftmikroskopie, die dynamische Lichtstreuung und die Laser Doppler Anemometrie. Damit konnten die Parameter Polyplex-Morphologie, Größe bzw. Zeta-Potential vor und nach den Vernebelungen bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die PEI Modifikationen, die am stärksten die pDNA komplexierten, die geringsten Veränderungen während der Vernebelung erfuhren. Dabei hatte das Polyethylenglycol-PEI (PEGPEI) die besten Eigenschaften hinsichtlich, DNA Komplexierung und Schutz bei der Vernebelung. Ein Vergleich der beiden Verneblersysteme ergab, dass alle Polyplexe am stabilsten während der Ultraschallverneblung waren. Als Schlussfolgerung dieser Studie, stellten wir die Ultraschall-Vernebelung als die geeignetere Methode für die Verabreichung von PEI-basierten Gentransfersystemen in die Lunge heraus. Des Weiteren sind die guten Stabilitätseigenschaften des PEGPEI hervorzuheben, auf Grund dessen wir in den darauf folgenden Studien PEGPEI als Vektor, neben dem Standartvektor verzweigtes 25 kDa PEI (BPEI), für die Pulmonale DNA Applikation verwendeten. Das Ziel der zweiten Studie (Kapitel 3) war die Entwicklung eines biokompatiblen und effizienten Systems für den Gentransport in die Lungen Epithelzellen. Dafür wurden zwei PEI Modifikationen verwendet, ein niedermolekulares PEI (LMWPEI) und das schon beschriebene PEGPEI, die mit dem Standart-Vektor BPEI verglichen wurden. Die Untersuchungen der Polyplex Morphologie (Rasterkraftmikroskopie), Größe (Dynamischer Lichtstreuung) und Zeta-Potential (Laser Doppler Anemometrie) zeigten, dass alle drei Polymere die pDNA vollständig kondensierten und mit dieser kleine, positiv geladene Partikel von ca. 100 nm formten. Zur Untersuchung der Polymer-Toxizität in vitro wurden MTT- und LDH-Assays durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass das LMWPEI die beste Biokompatibilität aufweist. Die Transfektionseffizienz der drei verschiedenen Vektoren wurde in vitro an einer Lungenepithelzelllinie und in vivo in Mäuselungen nach intratrachealer Instillation untersucht. Dabei wurde für LMWPEI im Vergleich zu BPEI und PEGPEI in vitro die geringste Genexpression detektiert, während die Transfektionsrate in der Mäuselunge für das LMWPEI am höchsten war. Interessanterweise beobachteten wir für PEGPEI ein genau gegensätzliches Verhalten und die sehr hohe Genexpression in der Zellkultur konnte in den Tierversuchen nicht reproduziert werden. Auf Grund dieser Beobachtungen stellten wir die Hypothese auf, dass eine gute Stabilität der Polyplexe im Mucus, im Surfactant und im Zellplasma, die Transfektion in vivo verändern könnten. Um dies zu untersuchen, wurden die Polyplexe mit Lavagen von Mäuselungen und mit natürlichem Surfactant inkubiert. Es konnte eine abnehmende Stabilität der Polyplexe in der Reihenfolge: PEGPEI > BPEI > LMWPEI beobachtetet werden. Daraus schlussfolgerten wir, dass starke Wechselwirkungen zwischen dem Polymer und der DNA in vivo zu einer schlechteren Freigabe der DNA führt und somit die Transfektionseffizienz verringert. Die Ergebnisse der Studie in Kapitel 3 zeigten, dass mittels LMWPEI im Tiermodel ein biokompatibler und effizienter Genvektor für die Lungentherapie entwickelt werden konnte. Diese viel versprechenden Ergebnisse gaben Anlass zu weiterführenden Studien über die Verträglichkeit von LMWPEI in der Mäuselunge (Kapitel 4). Dazu wurden die Polyplexe von LMWPEI im Vergleich zu BPEI und PEGPEI via Instillation in die Mäuselunge verabreicht und nach 48 Stunden wurden die Lungen lavagiert. Diese Lavagen wurden dann hinsichtlich Entzündungsfaktoren wie Gesamtzellzahl, Anzahl der Neutrophilen und der Makrophagen, Konzentration der Gesamtproteine und der Zytokine untersucht. Dabei wurden sowohl für die pDNA als auch die Polyplexe erhöhte Werte gemessen, diese konnten eingestuft werden in leichte Entzündungen bei der DNA und LMWPEI/DNA, mittlere Lungenentzündung bei BPEI/DNA und starke Lungenentzündung bei PEGPEI/DNA. Die Betrachtung dieser Ergebnisse im Zusammenhang mit den Transfektionsraten führte uns zu der Schlussfolgerung, dass mit zunehmender Toxizität in der Mäuselunge (LMWPEI BPEI > PEGPEI) abnimmt. Folglich wählten wir das LMWPEI für weitergehende Versuche zur Aerosolapplikation in die Lunge aus. Dafür entwickelten wir ein neues Inhalationssystem für Mäuse. Bedauerlicherweise nahmen die Transfektionsraten von LMWPEI/DNA nach der Vernebelung im Vergleich zur Instillation um den Faktor 50 ab. Um den Grund für diese drastische Abnahme zu erkunden, stellten wir Polyplexe her, bei denen sowohl die pDNA als auch das LMWPEI fluoreszenzmarkiert waren und verglichen deren Lungenverteilung nach Instillation mit der nach Inhalation. In den Konfocale Fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der Lungenschnitte zeigte sich, dass die vernebelten Polyplexe gleichmäßig in der Lunge verteilt waren, jedoch in sehr geringen Mengen. Im Gegensatz dazu waren die Polyplexe nach der Instillation in sehr hohen Konzentrationen sowohl in den Bronchien als auch in den Alveolen vorhanden, jedoch wurden nicht alle Abschnitte der Lunge erreicht. Des Weiteren beobachteten wir erstmalig, dass LMWPEI/DNA auch in die Lungenendothelzellen aufgenommen wurde. Zusammenfassend ergibt sich, dass LMWPEI ein sehr effizienter sowie biokompatibler Genvektor für die Lungentherapie ist, und diesbezüglich auch viel bessere Eigenschaften als das häufig eingesetzte BPEI aufweist. In einer weiteren Studie (Kapitel 5) ist die Entwicklung eines neuen Genvektors beschrieben, der mit einem TAT-Peptid (eine Proteintransduktionsdomaine) modifiziert wurde. Dazu wurde das TAT Peptid an BPEI über eine PEG-Kette kovalent gebunden. Dieses neue PEI Konjugat wurde, wie schon die zuvor beschriebenen Vektoren, hinsichtlich Kondensation der pDNA, Schutz der pDNA im extra- und intrazellulärem Lungenmilieu, Polyplexgröße, Stabilität, Zeta-Potential, in vitro und in vivo Transfektionseffizienz sowie Toxizität und Verteilung der Polyplexe in der Mäuselunge untersucht. Unser Ziel war es gewesen, einen nicht toxischen und sehr effizienten Genvektor zu entwickeln. Dies konnte mit dem neuem TAT-PEG-PEI weitgehend erreicht werden. Dieses Konjugat war in der Lage, sehr kleine und stabile Partikel mit pDNA zu formen. In der Mäuselunge wurde für die TAT-PEG-PEI Polyplexe ein Anstieg der Genexpression von ~600 % im Vergleich zu BPEI und ~300 % im Vergleich zu LMWPEI beobachtet. Weiterhin konnten wir eine hervorragende Verträglichkeit in vivo feststellen, und die Werte der Indikatoren eine Entzündungsrektion lagen im Bereich derer von pDNA. Ein weiterer Vorteil von TAT-PEG-PEI war der sichere Transport der pDNA in die verschiedenen Zellentypen der Lunge. Aus diesem Grund könnte dieser neu Genvektor für die Behandlung verschiedener Lungenerkrankungen eingesetzt werden, bei der verschiedenste Zelltypen betroffen sind, wie z.B. beim Lungenkrebs. Das wichtigste Ergebnis dieser vier beschriebenen Studien ist, dass TAT-PEG-PEI undim geringerem Maße auch LMWPEI als gut verträgliche und effiziente Vektoren das Potential besitzen, in der Gentherapie verschiedener Lungenerkrankungen Anwendung zu finden. Selbstverständlich sind weitergehende Studien notwendig, um die zwar geringe aber doch vorhandene Toxizität der Polyplexe weiter zu reduzieren. Dieses Ziel könnte beispielsweise erreicht werden, indem man für die Synthese von TAT-PEG-PEI das LMWPEI oder ein hochsubstituiertes PEGPEI verwendet. Des Weiteren sollte die Aufnahme von TAT-PEG-PEI Polyplexen in die Zelle genauer untersucht werden, da bisher widersprüchliche Studien über die Aufnahme und den Weg des TAT Peptides in der Zelle existieren. Weitergehende Studien hinsichtlich zellspezifischer Genvektoren sollten durchgeführt werden. Es wäre z.B. möglich, das LMWPEI mit einer zielgerichteten Struktur zu modifizieren, wie z.B. Lectin, Folat, einem Antikörper oder Peptiden wie z.B. das RGD. Der nächste Schritt sollte dann darin bestehen, therapeutische Gene (IL-12, p53, NO oder Prostacyclin Produzenten) mittels der optimierten Vektoren TAT-PEG-PEI und LMWPEI in die Lungenzellen zu transportieren. Des Weitern sollte versucht werden, das Vernebelungssystem für die in vivo Versuche zu verbessern, z.B. durch einen so genannten „Trocknenden Spacer“, wie er kürzlich von Rudolph et al. (2005) beschrieben wurde. Die fünfte Studie dieser Arbeit (Kapitel 6) beschreibt lipid-basierte Formulierungen als inhalierbare Drug Delivery Systeme. Der Wirkstoff Iloprost ist zugelassen in der Aerosoltherapie der Arteriellen Pulmonalen Hypertonie. Jedoch ist die Wirksamkeit dieses Stoffes begrenzt durch seine kurze Halbwertszeit. Infolgedessen war das Ziel der Studie die Entwicklung einer Formulierung, die Iloprost über einen verlängerten Zeitraum freisetzt. Solch eine Formulierung sollte beides gewährleisten: eine hohe Wirkstoffverkapselung und Stabilität während der Vernebelung. Dazu wurden verschiedene Lipidkombinationen für die Herstellung von Liposomen untersucht. Zuerst wurde die Modellsubstanz Carboxyfluorescein in Liposomen verkapselt, die aus Dipalmitoyl-phosphatidylcholin (DPPC) und Cholesterol (CH), oder aus DPPC, CH und PEG-dipalmitoyl-phoshatidylethanolamine (DPPE-PEG), bestanden. Die Stabilität dieser Liposomen wurde an drei verschiedenen Verneblern untersucht: Düsen-, Ultraschall- und Mikropumpenvernebler. Diese Systeme wurden hinsichtlich der Menge an produziertem Aerosol, der Aerosoltropfengröße und deren Einfluss auf die Liposomen verglichen. Dabei wurde die Stabilität der Liposomen in Bezug auf Liposomengröße und der Wirkstoffverkapselung, jeweils vor und nach der Vernebelung beurteilt. Es stellte sich heraus, dass die DPPC/CH Liposomen am stabilsten waren, insbesondere nach der Vernebelung mit dem Ultraschall- und dem Mikropumpenverneblern. In einer zweiten Versuchsreihe wurden die Liposomen mit Iloprost beladen. Dabei wurde die höchste Stabilität und Verkapselungseffizienz ebenfalls für die DPPC/CH Liposomen vor allem nach der Mikropumpenverneblung gefunden. Demzufolge schlussfolgerten wir, DPPC/CH Liposomen sind als eine Formulierung mit verlängerter Wirkstofffreigabe in der Behandlung der pulmonalen Hypertonie gut geeignet. Bis dieses Ziel erreicht werden kann, sind jedoch noch viele weiterführende Untersuchungen notwendig, und die hier präsentieren Ergebnisse stellen erst den Grundstein dafür dar. Als nächste Schritte sollten die Aufnahme der Liposomen in Lungenepithelzellen bzw. die Wirkstofffreisetzung untersucht werden, gefolgt von pharmakokinetischen ex vivo Studien. Danach sollte die Wirksamkeit der Iloprost-Liposomen an einem Tiermodel untersucht werden, bei dem, z.B. ausgelöst durch die Haltung in Hypoxie, eine pulmonale Hypertonie besteht. Die neuen Formulierungen und Technologien, die in dieser Dissertation beschrieben sind, stellen zwar nur einen kleinen, aber dennoch wichtigen Fortschritt in der Entwicklung von neuen Therapieformen für die Behandlung von Lungenerkrankungen dar. Derartige Formulierungen geben Anlass zur Hoffnung eines Tages die Behandlung von schwerkranken Patienten deutlich zu verbessern

Charge modified, comb-like graft-polyesters for drug delivery and DNA vaccination: Synthesis and Characterization of Poly(vinyl dialkylaminoalkylcarbamate-co-vinyl acetate-co-vinyl alcohol)-graft-poly(D,L-lactide-co-glycolide)s

In the present thesis a novel tailor-made polyester class based on amine-modified backbones and PLGA side chains was synthesized after designing its chemical structure under consideration of all necessary assumptions for a drug delivery system. Varying side chain length and amine substitution these polyesters can be especially designed for drug delivery problems. Their structure was clarified by NMR-spectroscopy and GPC-MALLS (multi-angle-laser-light-scattering). By variation of side chain length and /or amine substitution the solution and thermal behavior could be adjusted. Aimed amine substitution could be used to control degradation speed of the polyesters. Grafting of short side chain onto amine modified PVA converted a pure bulk erosion into a mixed surface and bulk erosion. To our knowledge this is the first time a degradation time of PLGA polyesters smaller than 15 days could be reached and could be freely modified by changing side chain length and amine substitution. Due to their solution and thermal behavior this polymer class is suitable for manufacturing of microparticles and implants. Using two dimensional NMR techniques like 1H-1H COSY, 1H-13C HMBC and 1H-13C HMQC a clear assignment of 1H and 13C NMR signals of the amine modified PVAs was established. The microstructure of the PVA backbones was investigated. It was demonstrated that some of the synthesized Polyesters have interesting transfection abilities in in-vitro experiments on L929 mouse fibroblasts. Especially, the particles formed by P(68)-10 feature an extraordinary high transfection even higher than that of PEI/DNA complexes. Holding the side chain length constant it was possible to increase transfection by increasing the amine substitution of the backbone. An opposite effect results at constant amine substitution and elongation of the PLGA chains

Insulin nanocomplexes formed by self-assembly from amine-modified poly(vinyl alcohol)-graft-poly(L-Lactide) for non-invasive mucosal delivery: Preparation, characterization and in vivo investigations

In this work biodegradable DEAPA-PVAL-g-PLLA nanocomplexes were investigated as a colloidal peptide carrier system for non-invasive transmucosal insulin delivery. Chapter 1 describes the basic fundamentals of insulin therapy, current status, problems and future trends. The pathogenesis of diabetes mellitus and the different treatment options are discussed to give an understanding of the necessity for alternative non-invasive application systems. It was emphasized that epithelial barriers and enzymatic degradation prevent effective transmucosal insulin delivery. The potential of colloidal bioadhesive polymeric carriers for oral, pulmonal or nasal application of insulin were discussed. The factors bioadhesivity and complexing-capability of polymers were considered with regard to literature. Reference was made to other fields where charge modified grafted polyester of theses novel class were already succesfully utilized for drug delivery. In Chapter 2 the DEAPA-PVAL-g-PLLA polymers were characterized for their substitution degree of amine-groups and the extent of lactide grafting. It was possible to manipulate the hydrophilic-hydrophobic balance of these polyesters by factors such as molecular weight, PLLA chain lengths and degree of amine-substitution. Water solubility of these polymers allowed the spontaneous self-assembling with insulin to small nano-sized complexes with narrow size distribution. The formulation of nanocomplexes made of polymers with varying structural composition were characterized for various physico-chemical characteristics, such as size distribution, surface charge and insulin association efficiency. Studies with isothermal titration calorimetry demonstrated the influence of the structural architecture on binding constants. An increase in binding affinity, drug loading, zeta potential and a decrease of complex size could be correlated with a higher substitution degree of DEAPA groups and a higher lactic acid grafting of the backbone. Systemic investigations of the complexation process, using nephelometric and light scattering techniques, allowed the evaluation of an optimal ratio of the binding partners. The complexes visualized by atomic force microscopy revealed a homogeneous particle collective with spheroidal complexes exhibiting an entangled internal structure. In Chapter 3 the suitability of insulin containing DEAPA-PVAL-g-PLLA nanocomplexes as a nasal insulin delivery system was studied under in-vivo conditions at wistar rats. Changes in blood glucose and insulin concentration were monitored in anaesthetized rats using a glucose meter and ELISA. The blood glucose response revealed a significant decrease of glucose concentration, which was accompanied by an increase of exogenous insulin concentration in rat blood. From the investigated two different NC options, the more amphiphilic variant with grafted lactic acid side chains was superior to the more hydrophilic backbone with no additional grafting. The pharmacological response observed in healthy rats was reproduced on streptozotocin induced diabetic rats, demonstrating in-vivo effectivness in diseased subjects respectively. A significant increase in relative bioavailability was observed at higher polymer concentrations for the grafted variant. The histological examination of the nasal mucosa with light microscopy showed no signs of toxicity on nasal morphology at the site of application after a single administration procedure. In Chapter 4 the interaction of DEAPA-PVAL-g-PLLA nanocomplexes with enterocyte-like Caco-2 cells in terms of cytotoxicity, transport through and uptake in the cell layers was investigated. The NC were compared against a nanoparticle formulation based on a higher grafted variant of DEAPA- PVAL-g-PLGA and prepared by a solvent displacement technique. The preformulated NP were loaded with insulin by surface adsorption. The comparison of permeability enhancing effects of nanocomplexes with the nanoparticle formulation, showed no significant differences. However, nanocomplexes physico-chemical properties and interaction with Caco- 2 monolayers varied strongly as a function of the polymer structural composition. The most effective carrier posses a combination of a hydrophilic backbone and hydrophobic side chains. On the other hand, this combination led to a higher amphiphilic, surfactant-like character of the polymer, which probably caused damages to membrane and tight junctions, as indicated by lactate dehydrogenase release and decrease of transepithelial resistance. However, since these effects seemed to be reversible and NC with a higher lactide-grafting showed the best protection capabilities against trypsinic degradation, the highest internalization and transport through Caco-2 monolayers, it may be assumed that these NC are suitable carriers for insulin to overcome mucosal absorption barriers

Erzeugung und Charakterisierung zielgerichteter liposomaler Trägersysteme für die Tumortherapie

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, drei neue liposomale Systeme für die zielgerichtete Tumortherapie zu entwickeln. Dafür wurden liposomale Oberflächen mit Zielsteuerungsmotiven, die mittels der Phage-Display-Technologie erzeugt wurden, modifiziert. Für das vaskuläre Targeting wurden als Liganden ein gegen Endoglin gerichtetes humanes scFv-Fragment und ein gegen die alpha-v-Integrine gerichtetes RGD-Peptid verwendet. Als Zielsteuerungsmotiv für den auf Tumorzellen lokalisierten EGF-Rezeptor diente ein derivatisiertes humanes EGF-Protein. Während das scFv-Fragment über eine Thioetherbindung an Maleimid-haltige Liposomen und das EGF-Protein über eine Carbonsäureamidbindung an N-hydroxysuccinimid-haltige Liposomen gerichtet gekoppelt werden konnte, wurde das RGD-Peptid als Lipopeptid in die liposomale Membran integriert. Die liposomalen Systeme wurden zuerst physiko-chemisch analysiert. Mittels in vitro-Studien konnte demonstriert werden, daß alle drei zielgerichteten liposomalen Systeme selektiv an die jeweiligen Zielzellen gebunden haben und von diesen aufgenommen wurden. Darüber hinaus wurde durch Kompetitionsexperimente nachgewiesen, daß die Bindung an die Zielzellen bzw. die Aufnahme in diese spezifisch über den jeweiligen Liganden vermittelt wurde. Die mit dem scFv-Fragment modifizierten und mit Doxorubizin beladenen Liposomen zeigten im Vergleich zu den gleichen Liposomen ohne Zielsteuerungsmotiv eine erhöhte in vitro-Zytotoxizität. Die gegen die alpha-v-Integrine gerichteten und mit Doxorubizin beladenen Liposomen konnten auch im Tierversuch das Tumorwachstum - verglichen mit den gleichen nicht-zielgerichteten Liposomen - stärker inhibieren. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde erfolgreich das Zytostatikum Cytarabin in eine neue liposomale Formulierung verpackt. Mittels dieser Liposomen konnte - verglichen mit freiem Cytarabin - eine signifikant verstärkte Inhibierung des Tumorwachstums im Tierversuch nachgewiesen werden

Biodegradable Paclitaxel-loaded Nanoparticles and Stent Coatings as Local Delivery Systems for the Prevention of Restenosis

Despite improved technologies restenosis remains the main problem of catheter-based interventions after a percutaneous transluminal angioplasty in artery disease. Local and sustained application of antiproliferative agents is a promising approach to solve the problem of intimal hyperplasia. In recent years, two different concepts for local drug delivery have attained increased importance: On the one hand, colloidal drug carriers, which can be infused directly into the vessel wall during the angioplasty procedure using special delivery catheters and on the other hand, the development of drug eluting stents. Biocompatible, biodegradable polymers are one of the most important instruments used to control the release of pharmacological active substances. A new type of branched, biodegradable polyesters, poly(vinyl alcohol)-graft-poly(lactide-co-glycolide) (PVA-g-PLGA), possesses very interesting features for the local and sustained release of paclitaxel. Therefore, the objective of this work was to investigate these polymers with regard to the preparation of paclitaxel loaded nanoparticles and stent coatings, and to evaluate their applicability as drug carriers to prevent intimal hyperplasia

Biodegradable amphiphilic PEG-PCL-PEI triblock copolymers designed for the self-assembly of multifunctional gene carriers

The great promise that gene therapy holds is the opportunity of directly introducing genetic material into cells for a causal therapy of yet incurable diseases. One promising way to achieve that goal is the usage of non-viral delivery vehicles, constructed from amphiphilic block copolymers. This thesis presents the establishment of a multifunctional PEG-PCL-PEI block copolymer platform, designed for multifunctional gene delivery. Across the scientific disciplines of chemistry, chemical physics, pharmacy and biomedicine the underlying work covers all aspects of non-viral gene delivery: In a first step, block copolymers were synthesised and characterised. In a systematic approach a library of compounds with varying hydrophilic/hydrophobic ratio was established. Subsequently, polymers were assembled into gene carriers followed by a non-invasive structural characterisation. Most importantly it was noticed, that polymers hydrophilic in nature formed smaller micelle-like carriers, whereas hydrophobic polymers aggregated to larger particle-like assemblies. In that vein, carrier features such as colloidal stability and toxicity were found to depend on chemical composition. Second, the nucleic acid loading process was optimised. Herein it was the overall goal to manufacture compactly condensed carrier complexes by understanding the basic principles of the electrostatic loading procedure. It was hypothesised that a more homogeneous fusion of charges is supposed to lead to superior carrier complexes. In that line, a microfluidic mixing technique, bringing cationic polymer and nucleic acid together at a constant ratio during the entire mixing process, was found to be the most promising technique. Ultimately, gene delivery carriers with superior colloidal stability, RNA protection and transfection efficiency were manufactured and process parameters were optimised with the help of a central composite design. Third, as a prerequisite for effective in vivo usage, carriers were transferred into stable ready-to-use formulations by lyophilisation with the help of glucose as a lyoprotectant. Unloaded nano-suspensions could be restored after rehydration by addition of small amounts of glucose. Upon loading of those rehydrated carriers, no significant difference in complex size or transfection efficiency was observed as compared to freshly-prepared ones. Moreover, the stabilisation of pre-formed carrier/siRNA complexes is feasible at elevated N/P and higher glucose concentrations. Fourth, most promising carriers where tested for their in vitro and in vivo transfection efficiency. Vectors constructed from rather hydrophobic block copolymers showed superior transfection efficiency, whereas poor performance was found in case of predominantly hydrophilic ones in a good correlation in vitro and in vivo. FACS studies revealed that this might possibly be due to reduced cell uptake of carriers with thicker PEG shell preventing cell interaction. In that way a yet active vector with diminished toxicity as compared to PEI homopolymers was evaluated. Fluorescent microscopy images of murine lung tissue revealed emission predominantly in the alveolar region, rendering this carrier system as promising for local treatment of airway diseases. Finally, the feasibility of multifunctional carrier co-loading and FRET-monitored nucleic acid unpacking was approved. Double-labelled nano-carriers emitted light at the acceptor’s emission wavelength upon donor excitation, proving successful FRET-effect and hence, complex integrity. The ability of dual loading is especially useful for “theranostic” purposes or co-delivery of nucleic acids and drugs. FRET-switching functionality may be advantageous for monitoring complex stability and nucleic acid unpacking. In view of prospective experiments, to circumvent the observed charge-toxicity-relationship, carriers are supposed to be taken up by the target tissue in a selective way. This can be achieved, up to a certain degree, via targeting ligands. Rather hydrophilic carriers with thicker PEG shells, increased colloidal stability and reduced toxicity represent the ideal candidates for this modification. In the long term, required work is evident: the development of more effective non-viral vectors and conquering the yet severe toxicity effects of current delivery systems. By a deeper understanding in the mechanistic aspects of the gene delivery process plus a rational vector design we are on the right track to achieve that goal

Magnetic iron oxide nanoparticles as potential contrast agents for magnetic resonance imaging

This thesis presents the development of novel formulations on the basis of magnetic iron oxide nanoparticles. Optimization of the synthesis route resulted in the development of particles meeting general requirements for eventual applications. Furthermore, the selection of appropriate stabilizing agents imparted the nanoparticles with beneficial features, making an in vivo application possible. In doing so, the formulations seem to be especially promising for the application as contrast agents in magnetic resonance imaging. Chapter 1 gives a brief insight into current research in the field of magnetic nanoparticles. While the originally promoted idea of dragging nanoparticles to the site of action by a massive external field is becoming less important, the use of magnetic carriers as single and multifunctional imaging agents is gaining in importance. Chapter 2 describes the synthesis of magnetic iron oxide nanoparticles with optimal properties for MRI contrast enhancement and the comparative assessment of polymeric macromolecules as stabilizers for such nanoparticles. It was revealed that particles covered by poly(ethylene imine)-g-poly(ethylene glycol) performed better than their poly(ethylene imine) counterparts, in terms of stability and cytotoxicity. The systems containing the former polymer showed pronounced colloidal stability even in protein-rich cell media. In addition, cytotoxicity was reduced by more than an order of magnitude. In this respect, the assumptions made in the run-up to the studies have found confirmation. Indeed, the introduction of hydrophilic poly(ethylene glycol) moieties to the polymer backbone positively manipulated the above properties. In addition, the physicochemical properties of the generated iron oxide nanoparticles were found to be excellent, despite the simplicity of the synthesis procedure. The iron oxide cores displayed high crystallinity, high saturation magnetization and superparamagnetic features. The polymer-coated nanoparticles were narrowly distributed around an average diameter of 40 nm and showed relaxation parameters comparable to presently marketed products. Given these results, the established magnetic ferrofluids appear to be interesting for an intracorporal application as an MRI contrast agent. The assumption that the configuration of magnetic nanoparticles affects cell uptake (mechanisms) and localization, and subsequently cellular MRI signaling, provided a basis for further studies. Chapter 3 includes the evaluation of oppositely charged iron oxide nanoparticle systems with regard to physicochemical properties, cell interaction and cell-constrained relaxometry. The findings of this section confirm that surface potential is the key factor controlling cell internalization of magnetic iron oxide nanoparticles. Particles with a positive zeta potential were taken up to an almost tenfold extent after 24 hours, and with faster kinetics than the negatively charged counterparts. Basically, these results confirm the preliminary assumptions that electrostatic attractive forces between the cell membrane and the nanoparticles favor an enhanced internalization of positive carriers. However, the clear discrepancy in overall uptake led to the conclusion that synergistic effects, such as colloidal stability, also influence the rate of particle accumulation in cells. Both systems were found to be compartmentalized in endosomes after their uptake into cells by a correspondent endocytotic pathway. This cellular confinement caused the relaxation parameters to change in comparison to freely dispersed nanosuspensions, in such a way that the signal contrast in T2-weighted MRI sequences degraded. Nevertheless, phantoms of cells incubated with positively charged nanoparticles still revealed effective signal darkening in these MRI sequences. The results suggest the suspensions examined as promising agents for cell tracking purposes, as here high iron uptake in combination with pronounced relaxivity is required

Synthese von neuartigen, Disulfid-verknüpften, bioabbaubaren Polyethylenglykol-Polyethylenimin-Copolymeren zur Anwendung in der Gentherapie

In der vorliegenden Dissertation wird die Synthese der neuartigen, disulfid-verbrückten, bioabbaubaren PEG-PEI-Copolymeren als nicht-virale Vektoren zur Gentherapie beschrieben. Die DNA-Polyplexe der Copolymere wurden charakterisiert und auf ihre Eignung als Genvektoren für die in-vivo-Anwendung untersuch

Novel techniques for the incorporation of proteins in biodegradable polymeric drug delivery devices for their controlled release

This thesis describes two novel technologies for the encapsulation of proteins in biodegradable polymers. Protein loaded nanofiber nonwovens and microparticles were manufactured and characterized regarding their suitability as drug delivery devices. Chapter 1 gave a detailed overview on the current status of electrospinning as a technique for the generation of nanofibrous scaffolds. Several biodegradable polymers (Poly(L-lactide) (PLLA) Resomer L210, poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) Resomer RG858 and Poly(ethylene carbonate) (PEC)) were investigated in Chapter 2 for their application in electrospinning of emulsions. Suitable process parameters were determined for all polymers to generate protein loaded nanofiber nonwovens (NNs). The resulting NNs were examined regarding their morphology and regarding their protein release profile. PLLA NNs released the protein very slowly and in a controlled manner. PLLA NNs exhibited the most promising characteristics and hence were chosen for further studies. In Chapter 3 protein loaded PLLA NNs were electrospun from differently concentrated solutions. The NNs featured a superhydrophobic surface and it was demonstrated, that the wettability of these scaffolds was the major factor influencing the protein release. Although TEM images showed that the major part of the protein was most likely located between the fibers and not encapsulated inside the fibers, the protein was released very slowly from the PLLA NNs. Only 20 – 30% of the protein was released within one month. The addition of hydrophilic polymers like poly(ethylene imine) (PEI) or poly(L-lysine) (PLL) to the aqueous phase of the electrospinning emulsion yielded NNs composed of polymer blends of PLLA and the respective hydrophilic polymer. It was demonstrated that the amount of added hydrophilic polymer had a significant effect on the release profile. A higher amount of hydrophilic polymer led to a faster release of the protein and gave us the opportunity to tailor the release profile of these NNs. Compositions of 5 or 10% PLL or PEI and 95 or 90% PLLA respectively, showed the most promising release profiles. Further screening of compositions ranging from 1 to 10% of hydrophilic polymers should be investigated to find the most appropriate release pattern. Whether NNs electrospun from emulsions are suitable scaffolds for their application in tissue engineering was determined in Chapter 4. The prepared NNs met all requirements for a tissue engineering scaffold: Mean fiber diameters of the scaffolds were very similar to fibrous protein structures of the extracellular matrix (ECM), meaning these scaffolds could physically resemble the ECM. Cell adhesion, cell proliferation and cell spreading on all NNs were at least as good as on a glass surface. For a composition of 5% PLL and 95% PLLA these values were even significantly higher. NNs took up water and swelled in the cell medium. The extent of swelling depended on the amount of hydrophilic polymer with a higher fraction leading to increased swelling. Cells still adhered to the fibers and were able to proliferate in all three dimensions. There were no significant differences in cell viability for cells grown on NNs compared to the cell viability on a glass surface. These results strongly suggest a huge potential of these nanofiber nonwovens for their application in tissue engineering. Chapter 5 gave an overview on microencapsulation focusing on phase separation and coacervation techniques. The development of these techniques and its application in the pharmaceutical industry were elucidated. The development of a new microencapsulation technique which utilizes an ionic liquid as one common solvent for a biodegradable polymer and a hydrophilic macromolecule was presented in Chapter 6. Some of the tested ionic liquids were good solvents for biodegradable polymers, but none of them was able to dissolve hydrophilic macromolecules. Even though there was no suitable ionic liquid among the tested compounds, the probability of finding a suitable ionic liquid is very high, since there are almost countless possibilities for the synthesis of different ionic liquids. Nevertheless the feasibility of encapsulating BSA via an emulsion based phase separation technique was demonstrated. Generally, it can be stated that the presented novel techniques for the encapsulation of proteins in biodegradable polymers demonstrated their huge potential for the preparation of drug delivery devices. Protein loaded nanofiber nonwovens exhibited very promising properties for their use as tissue engineering scaffolds and will definitely find application in this field. Screening the huge library of ionic liquids to find a compound with suitable solvent properties will be a difficult task, but the discovery of an appropriate ionic liquid will be a powerful tool for the encapsulation of proteins in microparticle

Untersuchungen zum Einsatz der Infrarot-Reflexionsspektroskopie zur Prozesskontrolle und Prozesssteuerung von Beschichtungen von oralen Filmen

In der vorliegenden Arbeit wurde die Eignung der Infrarot-Reflexionsspektroskopie in Verbindung mit der multivariaten Datenanalyse als prozessanalytische Methode zur in-line und at-line Prozesskontrolle von kritischen Qualitätsmerkmalen während der Beschichtung von Laminaten für orale Filme untersucht. Es sollte eine prozessanalytische Methode entwickelt werden, die es ermöglicht unabhängig von der gravimetrischen Inprozesskontrolle und dem Surrogatparameter Flächengewicht kritische Qualitätsmerkmale während des Beschichtungsprozesses bestimmen und überwachen zu können. Die Versuche zur in-line und at-line Prozesskontrolle gliederten sich dabei in zwei unabhängige Versuchsteile bei denen zwei unterschiedliche Sensoren/Spektrometer mit unterschiedlichen spektralen Bereichen eingesetzt wurden. Im ersten Versuchsteil konnte mit Hilfe des Infrarot-Reflexionssensors der Firma Honeywell (Reflectance Infrared Sensor (RIS) 3-4810) eine prozessanalytische Methode entwickelt werden, die es ermöglicht in-line und in Echtzeit die Restfeuchte während des Beschichtungsprozesses eines dreischichtigen Laminates zu überwachen und zu kontrollieren. Die im Vorversuch zur Quantifizierung der Restfeuchte identifizierten Absorptionsbanden bei 1974 nm und 2663 nm konnten gemäß Angaben aus der Literatur der Kombinationsschwingung der O-H Valenz- und der H-O-H Deformationsschwingung ( O-H+ O-H) und der O-H Valenzschwingung ( O-H) zugeordnet werden. Mit Hilfe von Echtzeitspektren, welche während des Beschichtungsprozesses gewonnen wurden, konnten für die zweischichtige Deckschicht und für das dreischichtige Gesamtlaminat Modelle zur Restfeuchtequantifizierung basierend auf dem PLS1 Algorithmus entwickelt werden. Modelle mit der multiplikativen Streukorrektur MSC als Datenvorbehandlungsmethode lieferten dabei die besten Vorhersageergebnisse und zeigten auch das beste Ergebnis für die erklärte Varianz der X-Daten und der Y-Daten. Aufgrund der guten Ergebnisse aus der Kalibrierung und der internen Kreuzvalidierung wurden die MSC Modelle mittels eines unabhängigen Beschichtungsprozesses extern validiert. Die bei der externen Validierung ermittelten Standardfehler SEP waren mit den Standardfehlern SEC und SECV aus der Kalibrierung und internen Kreuzvalidierung vergleichbar. Die Bestimmtheitsmaße R²C und R²P waren für das Modell der Deckschicht und das Modell des Gesamtlaminats zufriedenstellend. Es konnte für beide erstellten Modelle keine signifikante Abweichung zwischen der anhand der MSC Modelle vorhergesagten Restfeuchte und der Restfeuchte bestimmt nach der Referenzmethode Karl-Fischer festgestellt werden. Die Vorversuche zur Detektion des Fentanylcitratgehalts im wirkstoffhaltigen Gesamtlaminat zeigten, dass keine charakteristischen Absorptionsbanden im spektralen Bereich von 1600-4100 nm identifiziert werden konnten. Die im Versuch identifizierte Absorptionsbande im spektralen Bereich von 1974 nm beruht auf der O-H Kombinationsschwingung des Wassers und kann nicht zur quantitativen Bestimmung von Fentanylcitrat verwendet werden. Um den Wirkstoffgehalt dennoch während der Beschichtung neben der Restfeuchte quantitativ in Echtzeit erfassen zu können, müsste in weiteren Untersuchungen evaluiert werden, ob neben der Infrarot-Reflexionsspektroskopie eine andere spektroskopische Messmethode aus prozessanalytischer Sicht geeignet ist. Als Beispiel hierbei sei die Raman-Spektroskopie zu nennen. Die Erfassung des Fentanylcitratgehalts über eine in-line Prozesskontrolle in Echtzeit würde wie im Fall der Restfeuchtebestimmung zeitnahe Reaktionen auf Schwankungen während des Beschichtungsprozesses ermöglichen, um den Wirkstoffgehalt in vordefinierten Bereichen zu halten und so mögliche Fehlproduktion einhergehend mit Materialverlusten zu minimieren. Die Ergebnisse zur Restfeuchtebestimmung der wirkstofffreien Deckschicht und zum dreischichtigen Gesamtlaminat zeigen, dass unter Verwendung multivariater Modelle die Infrarot-Reflexionsspektroskopie zur in-line und Echtzeit-Prozesskontrolle der Restfeuchte während des Beschichtungsprozesses geeignet ist. Mit Hilfe der neuen prozessanalytischen Methode ist es nun möglich, unabhängig von der gravimetrischen Inprozesskontrolle zerstörungsfrei und ohne weiteren Probenzug während des Beschichtungsvorganges die Restfeuchte in Echtzeit zu überwachen und zu kontrollieren. Mit Hilfe der Erfassung der Restfeuchte in Echtzeit kann mit dem aus der gravimetrischen Inprozesskontrolle ermittelten Flächengewicht das Trockengewicht des Laminates nun zeitnah errechnet werden und ermöglicht so ohne zeitliche Verzögerung die Berechnung des Flächengewichtes der wirkstoffhaltigen mucoadhäsiven Schicht aus der Differenz des Trockenflächengewichtes des dreischichtigen Gesamtlaminates und dem Trockenflächengewicht der wirkstofffreien, zweischichtigen Deckschicht. Mit Hilfe der Erfassung der Restfeuchte in Echtzeit sind nun kurzfristige Reaktionen auf Schwankungen innerhalb des Beschichtungsprozesses möglich, um so die Homogenität des Gesamtlaminates in Hinblick auf den Wirkstoffgehalt zu gewährleisten. Der Fehlversuch bei der externen Validierung des Modells zur Restfeuchtebestimmung des dreischichtigen Gesamtlaminates machte deutlich, dass die Erfassung der Restfeuchte mittels der Karl-Fischer Methode nicht nur vom Analysenzeitpunkt sondern auch von der Lagerdauer und Lagerbedingung abhängig ist. Der Fehlversuch und die generell mehr Zeit in Anspruch nehmende Restfeuchtbestimmung nach Karl-Fischer unterstreicht die Notwendigkeit der Einführung einer in-line Prozesskontrolle in Echtzeit, um Fehler bei der Erfassung der Restfeuchte zu minimieren und die Restfeuchtenanalyse zu beschleunigen, um die Prozesssicherheit und eventuelle Fehlproduktionen während der Beschichtung zu vermeiden. In einem weiteren Versuch konnte basierend auf der Herstellung eines nikotinhaltigen Laminates auf einer Beschichtungsanlage unter Produktionsbedingungen gezeigt werden, dass mit Hilfe des Infrarot-Reflexionssensors der Firma Honeywell eine in Echtzeit erfolgende quantitative in-line Prozesskontrolle des Wirkstoffs Nikotin während der Beschichtung möglich ist. Es ist eine Arbeit bekannt, bei der die Nahinfrarotspektroskopie zur Quantifizierung von Nikotin in transdermalen therapeutischen Systemen eingesetzt wurde, es sind jedoch keine Arbeiten bekannt, bei denen die Eignung der Infrarot-Reflexionsspektroskopie zur prozessanalytischen Quantifizierung von Nikotin in oralen Filmen in Echtzeit aufgezeigt werden konnte. Basierend auf einer Machbarkeitsstudie unter Laborbedingungen wurden charakteristische Absorptionsbanden von Nikotin in einer Methacrylsäure-Ethylacrylat Copolymer Matrix identifiziert. Mit Hilfe von Echtzeitspektren welche während der Beschichtung auf einer Beschichtungsanlage im Produktionsmaßstab gewonnen wurden, wurden fünf verschiedene auf dem PLS1 Algorithmus basierende Kalibriermodelle erstellt. Kalibrierungsmodell Nummer 2 mit der multiplikativen Streukorrektur (MSC) als Datenvorbehandlung und einem PLS Faktor zeigte im Vergleich zu den übrigen erstellten Modellen zwar nicht die kleinsten, aber die in der Größenordnung vergleichbarsten Standardfehler SEC und SECV. Das Modell zeigte das beste Ergebnis für den Anteil der erklärten Varianz der Y-Daten für den ersten PLS Faktor und das beste Verhältnis zwischen der erklärten Varianz der X- und Y-Daten. Die im Modell identifizierten Absorptionsbanden im spektralen Bereich von 2289-2722 nm stammen von der Kombinationsschwingung der C-H Valenz- und der C-H2 Deformationsschwingung ( C-H+ C-H2) und der C-H Valenzschwingung ( C-H) des Nikotins und sind mit dem spektralen Bereich von 2250-2761 nm aus der Machbarkeitsstudie vergleichbar. Der in einer externen Validierung mit einem unabhängigen Laminat ermittelte Standardfehler SEP war mit dem Standardfehler SEC und SECV aus der Kalibrierung und der internen Kreuzvalidierung vergleichbar. Anhand eines durchgeführten Zweistichproben t-Tests konnte eine korrekte Vorhersagegenauigkeit des Nikotingehaltes für das Kalibriermodell Nummer 2 bestätigt werden, da keine signifikante Abweichung zwischen wahrem Nikotingehalt und vorhergesagtem Nikotingehalt festgestellt werden konnte. Basierend auf den spektroskopischen Daten konnte erstmals eine prozessanalytische Methode entwickelt werden, die es ermöglicht, nondestruktiv den Nikotingehalt während der Beschichtung eines oralen Films unabhängig von der gravimetrischen Inprozesskontrolle und dem Surrogatparameter Flächengewicht zu überwachen und zu kontrollieren. Bisher war es nicht möglich den Nikotingehalt während des ganzen Beschichtungsprozesses unabhängig von der gravimetrischen Inprozesskontrolle zu überwachen und zu kontrollieren. Der Nikotingehalt des Laminates wurde bisher lediglich über den Surrogatparameter Flächengewicht kontrolliert. Die Ermittlung des wahren Nikotingehaltes erfolgte erst auf der Stufe der vereinzelten oralen Filme. Mit der Einführung der neuen prozessanalytischen Methode basierend auf der Infrarot-Reflexionsspektroskopie ist nun das kontinuierliche Sammeln von Daten während der Beschichtung möglich, was zeitnahe Reaktionen auf Schwankungen innerhalb des Beschichtungsprozesses ermöglicht, um den Nikotingehalt des Laminates in vordefinierten Grenzen zu halten. Durch die neue prozessanalytische Methode kann die Homogenität des Laminates wesentlich besser gewährleistet werden und ermöglicht so die Vermeidung von Fehlproduktionen einhergehend mit erhöhten Kosten und Materialverlusten. Im zweiten Versuchsteil wurde mit Hilfe des eingesetzten Polarisations Fourier-Transform-Nahinfrarot (FT-NIR) Spektrometers der Firma BÜCHI (NIRFlex N-500 untersucht, ob für die Beispielwirkstoffe Dexamethason und Rizatriptanbenzoat basierend auf spektroskopischen Daten aus dem Nahinfrarotbereich Modelle zur at-line Prozesskontrolle von oralen Filmen während des Beschichtungsprozesses entwickelt werden können. Für die Erstellung eines quantitativen Modells zur Bestimmung von Dexamethason wurde basierend auf einer Machbarkeitsstudie durch Vergleich der mit der ersten Ableitung (1st) und der multiplikativen Streukorrektur (MSC) vorbehandelten Spektren von Dexamethason und Hydroxypropylmethylcellulose und der Berücksichtigung der aus der Literatur bekannten Absorptionsbanden von Wasser im untersuchten spektralen Bereich von 10000 cm-1 – 4000 cm-1, nur der spektrale Bereich zwischen 5000 cm-1 und 4000 cm-1 zur Erstellung eines quantitativen Modells verwendet. Die im spektralen Bereich zwischen 5000 cm-1-4000 cm-1 identifizierten scharfe Absorptionsbanden von Dexamethason sind vermutlich auf die Kombinationsschwingungen der C-H Valenz- und C-H Deformationsschwingungen ( C-H+ C-H) des Steroidgerüstes zurückzuführen. Zur Generierung von Modellen basierend auf dem PLS1-Algorithmus wurden unter Laborbedingungen Massen unterschiedlicher prozentualer Zusammensetzung von Dexamethason und Hydroxypropylmethylcellulose hergestellt. Der Vergleich der Vorhersageergebnisse für den Dexamethasongehalt der eingesetzten unabhängigen Validierungsproben lieferte für das Kalibriermodell Nummer 4 mit der Kombination der Spektrendatenvorbehandlungsmethoden der ersten Ableitung (1st) und der multiplikativen Streukorrektur (MSC) die besten Vorhersageergebnisse. Anhand der graphischen Gegenüberstellung der berechneten Abweichungen zwischen wahrem Dexamethasongehalt und vorhergesagtem Dexamethasongehalt der Validierungs- und der Kalibrierungsproben, konnte keine signifikante Abweichung festgestellt werden. Die ermittelten Ergebnisse zeigen, dass für das Kalibriermodell Nummer 4 eine korrekte Vorhersagegenauigkeit nachgewiesen werden konnte und dass unter Verwendung multivariater Modelle die Infrarot-Reflexionsspektroskopie für die quantitative Bestimmung von Dexamethason in oralen Filmen auf HPMC-Basis geeignet ist und zur at-line Prozesskontrolle eingesetzt werden kann. Bevor ein quantitatives Modell zur Bestimmung von Rizatriptanbenzoat entwickelt werden konnte, wurde ebenfalls mit Hilfe einer durchgeführten Machbarkeitsstudie der spektrale Bereich zwischen 4800-4050 cm-1 identifiziert in dem Rizatriptanbenzoat gegenüber Hydroxypropylcellulose und dem verwendeten VP/VA Copolymer charakteristische Absorptionsbanden aufweist. Identifizierte Absorptionsbanden zwischen 4300-4050 cm-1 sind auf den Benzolring von Rizatriptanbenzoat zurückzuführen und stammen von der C-H, C-C Kombinationsschwingung der C-H Valenz- und C-C Deformationsschwingung ( C-H+ C-C) und der C-H Kombinationsschwingung der C-H Valenz- und C-H Deformationsschwingung ( C-H+ C-H). Die Absorptionsbande bei ca. 4400 cm-1 stammt vermutlich von der N-H Kombinationsschwingung der N-H Valenz- und N-H Deformationsschwingung ( N-H+ N-H) des Indols. Da bei der Herstellung der Massen Methylethylketon als Lösungsmittel verwendet wurde, wurde mit Hilfe eines Trocknungsversuches unter Raumtemperaturbedingungen nachgewiesen, dass nach einer Trocknungszeit von 10 Minuten keine charakteristischen Absorptionsbanden mehr von dem eingesetzten Lösungsmittel Methylethylketon identifiziert werden können. Da für die Erstellung von spektroskopischen Modellen die hergestellten Laminate für 10 Minuten in einem Trockenschrank bei 60°C getrocknet wurden, konnte davon ausgegangen werden, dass die Absorptionsbanden des reinen Methylethylketons bei der Modellerstellung nicht berücksichtigt werden müssen. Basierend auf dem PLS1-Algorithmus wurden anhand von im Labormaßstab hergestellten Laminaten mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen fünf Modelle mit unterschiedlichen Datenvorbehandlungsmethoden erstellt. Kalibriermodell Nummer 4 mit der Datenvorbehandlungskombination erste Ableitung (1st) und multiplikative Streukorrektur (MSC) zeigte dabei die beste Vorhersagegenauigkeit. Anhand der ermittelten Standardfehler SEC und SEP und der ermittelten mittleren Fehler RMSEC und RMSEP der Kalibrierung und Validierung konnte für das Kalibriermodell Nummer 4 die beste Vorhersagegenauigkeit nachgewiesen werden. Mit Hilfe eines durchgeführten Zweistichproben t-Tests konnte gezeigt werden, dass keine signifikante Abweichung zwischen den wahren und vorhergesagten Rizatriptanbenzoatgehalten besteht. Die Ergebnisse zeigen, dass unter Verwendung der Infrarot-Reflexionsspektroskopie ein quantitatives Modell entwickelt werden konnte, welches ermöglicht Rizatriptanbenzoat in oralen Filmen basierend auf einer HPC und VP/VA Copolymer Matrix zu bestimmen. Anhand der Beispielwirkstoffe Dexamethason und Rizatriptanbenzoat konnte im zweiten Versuchsteil gezeigt werden, dass mittels des eingesetzten Polarisations Fourier-Transform-Nahinfrarot (FT-NIR) Spektrometers der Firma BÜCHI (NIRFlex N-500) prozessanalytische Methoden zur at-line Prozesskontrolle von oralen Filmen während des Beschichtungsprozesses entwickelt werden können. Basierend auf den Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass wenn aufgrund baulicher oder technischer Maßnahmen eine in-line Prozesskontrolle in Echtzeit nicht erfolgen kann, die at-line Prozesskontrolle mittels der Infrarot-Reflexionsspektroskopie geeignet ist, um unabhängig von der gravimetrischen Flächengewichtskontrolle Wirkstoffe während des Beschichtungsvorganges überwachen zu können, um so zeitnahe Korrekturen des Beschichtungsprozesses ermöglichen zu können. Zusammenfassend lässt sich als Resultat der Arbeit aufzeigen, dass erstmals basierend auf spektroskopischen Daten prozessanalytische Methoden zur in-line und at-line Prozesskontrolle von kritischen Qualitätsmerkmalen während des Beschichtungsprozesses von oralen Filmen entwickelt werden konnten. Es sind Studien zum Einsatz der Nahinfrarotspektroskopie auf dem Feld der pharmazeutischen Anwendung von oralen Filmen bekannt, jedoch sind keine Arbeiten bekannt, bei denen die Infrarot-Reflexionsspektroskopie als prozessanalytische Methode zur in-line und at-line Prozesskontrolle von Beschichtungen von oralen Filmen eingesetzt wird. Bisher war es nicht möglich kritische Qualitätsmerkmale wie Restfeuchte oder Wirkstoffgehalt unabhängig von der gravimetrischen Inprozesskontrolle während der Beschichtung zu überwachen und zu kontrollieren. Kritische Qualitätsmerkmale wurden bisher nur über den Surrogatparameter Flächengewicht bestimmt und kontrolliert und erst auf der Stufe der vereinzelten oralen Filmen auf den wahren Gehalt hin überprüft. Gemäß den Zielen der PAT-Initiative ist es nun möglich, basierend auf der Einführung einer neuen prozessanalytischen Methode ein System aufzubauen, in dem zeitnahe Messungen an kritischen Qualitätsmerkmalen durchgeführt werden können, mit dem Ziel, die Qualität des Endproduktes sicherzustellen. Basierend auf den zeitnahen Messungen von kritischen Qualitätsmerkmalen können nun schneller Korrekturen während des Beschichtungsprozesses eingeleitet werden, um die zu überwachenden Parameter in vordefinierten Grenzen zu halten. Die neuen prozessanalytischen Methoden zur in-line und at-line Prozesskontrolle bieten die Möglichkeit einer kontinuierlichen Qualitätssicherung, Prozessvalidierung und Prozessweiterentwicklung. Die Prozesssicherheit eines Beschichtungsprozesses kann durch die Einführung von in-line und at-line Prozesskontrollen wesentlich verbessert werden, um die Homogenität des hergestellten Laminates in Bezug auf die Anforderungen des europäischen Arzneibuchs hinsichtlich der Monographie "Gleichförmigkeit des Gehalts" gewährleisten zu können. Um letztendlich das Ziel des Einsatzes von PAT die Real-Time-Release (RTR) verwirklichen zu können, müssen die prozessanalytischen Methoden zur in-line und at-line Prozesskontrolle nach den Richtlinien der ICH Guideline Q2 validiert werden. Real-Time-Release bedeutet die Chargenfreigabe im Sinne einer parametrischen Freigabe auf Basis von im laufenden Prozess erhobenen Daten, anstelle der separaten analytischen Freigabeprüfung am Freigabeprodukt. Die Qualität des finalen Produktes wird ausschließlich aus Inprozesskontrollen oder Prozessdaten abgeleitet. In weiteren Versuchen sollte noch überprüft werden, ob die Echtzeitdaten aus der in-line Prozesskontrolle in einem elektronischen Schaltkreis mit der Steuerungseinheit der Beschichtungsanlage verbunden werden können, um so in einem Automatisierungsprozess die Beschichtungsgeschwindigkeit , das Trockenprofil oder die Spalteinstellungen des Auftragswerks so zu korrigieren, so dass nach Auftreten von außerhalb vordefinierter Grenzen liegender kritischer Qualitätsmerkmale Korrekturmaßnahmen eingeleitet werden können. Mit Hilfe der Einführung eines Regelschaltkreises könnte die Prozesssicherheit des Beschichtungsprozesses weiter verbessert werden. Die vorliegenden Ergebnisse der Arbeit zeigen auch, dass die notwendigen Kalibrierungs- und Validierungsmaßnahmen hinsichtlich der Entwicklung geeigneter spektroskopischer Modelle zur in-line und at-line Prozesskontrolle allerdings zeitaufwendig sind und die Produktion einer Reihe von Proben unterschiedlicher Konzentrationen unter Produktions- oder Laborbedingungen erfordern. Die multivariate Datenanalyse zur Auswertung der gewonnen spektralen Daten erfordert zusätzlich einen Optimierungsschritt hinsichtlich der Auswahl geeigneter Regressionsmethoden und der Auswahl geeigneter Spektrenvorbehandlungs-methoden, welche wesentlich durch den eingesetzten Datensatz an aufgenommenen Spektren beeinflusst werden. Zusätzlich sollte berücksichtigt werden, dass die entwickelten spektroskopischen Modelle den Fehler der Referenzmethode hinsichtlich der Probenvorbereitung und Probenhandhabung enthalten