Untersuchungen zur Rolle der Mitochondrien bei der kälteinduzierten Apoptose kultivierter Zellen

In dieser Arbeit wurde der durch kalte Inkubation transplantationsrelevanter Zellen in Organprotektionslösungen induzierte Zelltod untersucht. Hierzu wurden Leberzellen - Hepatozyten und Leberendothelzellen - in University of Wisconsin-(UW-)Lösung, Corneaendothelzellen in McCarey-Kaufmann-Medium und alle drei Zelltypen zum Vergleich in Zellkutlurmedium einer aeroben Kaltinkubation ausgesetzt und anschließend auf physiologische Teperaturen wiedererwärmt. Unter diesen Bedingungen konnte sowohl in den Endothelzellen als auch in Hepatozyten eine im Wesentlichen eiseninduzierte apoptotische Zellschädigung ausgelöst werden. Weiterführende Untersuchungen an Hepatozyten belegten, dass diese kälteinduzierte Apoptose mechanistisch über eine kältebedingte Erhöhung des chelatisierbaren Eisenpools der Zellen und eine dadurch ausgelöste oxidative Schädigung verläuft, welche z.B. in Form einer gesteigerten Lipidperoxidation oder DNA-Fragmentation evident wird. Eine in vielen Schädigungsmodellen diskutierte zusätzliche Erhöhung primärer ROS (O2 - und/oder H2O2) ist in den Schädigungsmechanismus der kälteinduzierten Apoptose nicht involviert, im Gegenteil war die Bildung dieser Spezies in der Kälte sogar deutlich niedriger als in Wärmekontrollen. Während der Mechanismus der kälteinduzierten Apoptose von Endothelzellen vom verwendeten Inkubationsmedium unabhängig war, konnte bei Hepatozyten zusätzlich zu der in UW-Lösung detektierten eisenabhängigen Zellschädigung ein eisenunabhängiger Schädigungsweg identifiziert werden, wenn die Kaltinkubation der Zellen in Zellkulturmedium erfolgte. Diese, nur bei Kaltinkubationstemperaturen unterhalb von 13°C nachzuweisende zusätzliche Komponente trat morphologisch in der Wiedererwärmungsphase der Hepatozyten durch eine massive Zellablösung, Blebbildung und Verstärkung der Kernschädigung in Erscheinung und konnte anhand von Hemmstoffexperimenten als proteasevermittelte Schädigung identifiziert werden. Den wahrscheinlich bedeutendsten Endpunkt des eiseninduzierten Schädigungsweges der untersuchten Leber- und Corneazellen bei und nach der Kaltinkubation stellt die Zerstörung der mitochondrialen Funktion dar. Schon während der Kaltinkubationsphase kam es zu einer, allerdings grundsätzlich reversiblen, Erniedrigung des mitochondrialen Membranpotentials; in der anschließenden Wiedererwärmung der Zellen wurde der mitochondriale Permeabilitätsübergang (MPT) induziert, dem in Hepatozyten innerhalb weniger Minuten, in Endothelzellenetwas langsamer, der Zelltod folgte. Eine mögliche Auslösung dieses im mechanistischen Verständnis der Apoptose sehr schnell auf die MPT folgenden Zelltodes über eine plötzliche Freisetzung ROS aus der durch die MPT zerstörten mitochondrialen Atmungskette konnte ansatzweise bestätigt werden: in der Kälte konnte durch Eisenchelatisierung (und damit Schutz vor einer MPT) die Freisetzung von O2 - erniedrigt und in der Wiedererwärmung eine erhöhte Bildung von ROS durch die Oxidation eines ROS-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs demonstriert werden. Neben dieser für den Mechanismus der kälteinduzierten Apoptose bedeutenden irreversiblen mitochondrialen Schädigung konnte eine generell reversible kälteinduzierte Veränderung der mitochondrialen Morphologie beobachtet werden. Diese war gekennzeichnet durch eine markante, eisenunabhängige Verkürzung der Mitochondrien in der Kaltinkubationsphase, die bei Leber- und Corneaendothelzellen, nicht jedoch in Hepatopzyten, in der Wiedererwärmung in einer mitochondrialen Ultrakondensation mündete. Durch Hemmung der eisenabhängigen Schädigung konnte diese Ultrakondensation verhindert und eine Wiederherstellung der ursprünglichen mitochondrialen Morphologie in der Wiedererwärmung bewirkt werden. Da in allen drei untersuchten Zelltypen nach Kaltinkubation und Wiedererwärmung eine eisenvermittelte kälteinduzierte Apoptose nachweisbar war, kann aus den erzielten Daten abgeleitet werden, dass diese Zellschädigung offensichtlich zelltypübergreifend auftritt. Wegen der besonderen Bedeutung der Kaltlagerung im Rahmen der Organtransplantation sollte ein möglichst guter Schutz der Gewebe vor einer kälteinduzierten Apoptose angestrebt werden, was auf der Basis der hier dargestellten Befunde am Besten durch den Zusatz eines effektiven, membranpermeablen Eisenchelators zu einer die eisenunabhängige Schädigung unterdrückenden Konservierungslösung geschehen sollte

Population Pharmacokinetic Analysis of Circadian Rhythms in Hepatic CYP3A Activity Using Midazolam

Diurnal changes in the activity of drug metabolizing enzymes may contribute to the variability in drug disposition and drug effects. The aim of this study was to quantify the circadian rhythmicity exhibited by hepatic CYP3A. A 10g/kg intravenous bolus dose, followed by a 30-hour 4g/kg/h intravenous infusion of midazolam, used as a probe substrate for hepatic CYP3A activity, was administered to 16 healthy volunteers (8 males and 8 females). Blood samples were drawn hourly for 24hours after achieving steady state, and plasma concentrations of midazolam and its main metabolite 1-OH midazolam were determined. Population pharmacokinetic analysis was performed using nonlinear mixed effects modeling. One-compartment pharmacokinetic models best described midazolam and 1-OH midazolam pharmacokinetic disposition. An unequivocal but minor diurnal pattern was identified in the midazolam plasma concentration profiles, which was described using a cosine function with a 24-hours period. The fluctuation in the relative CYP3A activity ranged between 10% above average around 15:00, and 10% below average around 03:00. None of the covariates tested had a significant impact on the parameters estimated. Although a diurnal pattern in hepatic CYP3A activity was identified, its magnitude suggests that it is small and without clinical significance for drug therapy