The role of local and remote amino acid substitutions for optimizing fluorescence in bacteriophytochromes: A case study on iRFP

Bacteriophytochromes are promising tools for tissue microscopy and imaging due to their fluorescence in the near-infrared region. These applications require optimization of the originally low fluorescence quantum yields via genetic engineering. Factors that favour fluorescence over other non-radiative excited state decay channels are yet poorly understood. In this work we employed resonance Raman and fluorescence spectroscopy to analyse the consequences of multiple amino acid substitutions on fluorescence of the iRFP713 benchmark protein. Two groups of mutations distinguishing iRFP from its precursor, the PAS-GAF domain of the bacteriophytochrome P2 from Rhodopseudomonas palustris, have qualitatively different effects on the biliverdin cofactor, which exists in a fluorescent (state II) and a non-fluorescent conformer (state I). Substitution of three critical amino acids in the chromophore binding pocket increases the intrinsic fluorescence quantum yield of state II from 1.7 to 5.0% due to slight structural changes of the tetrapyrrole chromophore. Whereas these changes are accompanied by an enrichment of state II from ~40 to ~50%, a major shift to ~88% is achieved by remote amino acid substitutions. Additionally, an increase of the intrinsic fluorescence quantum yield of this conformer by ~34% is achieved. The present results have important implications for future design strategies of biofluorophores.DFG, 221545957, SFB 1078: Proteinfunktion durch ProtonierungsdynamikDFG, 53182490, EXC 314: Unifying Concepts in Catalysi

Chemometrische Analysestrategien für Raman-spektroskopische Daten

Gegenstand dieser Arbeit sind chemometrische Methoden zur Analyse komplexer Datensätze, die mittels Raman-Spektroskopie erzeugt werden. Anhand exemplarischer Problemstellungen werden geeignete Strategien zur Dechiffrierung der chemischen und physikalischen Informationen eines biologischen oder chemischen Systems aus experimentellen Spektren dargestellt und bewertet. Gemeinsames Ziel der verwendeten methodischen Ansätze ist die Bestimmung der Eigenspektren der zum System gehörigen Spezies (Komponentenanalyse). Die so gewonnenen Komponentenspektren dienen dann der Bestimmung der quantitativen Verteilung zwischen den Spezies bzw. struktureller, thermodynamischer oder kinetischer Zusammenhänge. Die Arbeit zeigt die Vielfalt der Einsatzmöglichkeiten der quantitativen Spektrenanalyse und ihrer computergestützten Automatisierung. Am Beispiel der Qualitätskontrolle von Kaffeebohnen wurde gezeigt, dass zur qualitativen und quantitativen Unterscheidung zweier Spezies schon ein singulärer spektraler Marker ausreichend sein kann, dessen Natur nicht notwendigerweise bekannt sein muss. Durch den Einsatz algorithmischer Verfahren kann die Kontrolle statistisch aussagekräftiger Stichproben beschleunigt werden. Die Raman-Spektroskopie ermöglicht jedoch nicht nur die Unterscheidung von Spezies sondern auch ihre strukturelle Charakterisierung. Am Beispiel des biologischen Photorezeptors Rhodopsin werden Möglichkeiten der Strukturbestimmung bei strukturell variablen Systemen aufgezeigt und diskutiert. Die Ermittlung der Komponentenspektren von Spezies, die in einem Gleichgewicht vorliegen, eröffnet die Bestimmung thermodynamischer Zustandsgrößen. Als Beispiel wurden dazu die Raman-Spektren eines prototypischen Phytochroms temperaturabhängig gemessen und verschiedene Methoden der Datenanalyse vorgestellt und diskutiert. Im letzten und gleichzeitig komplexesten Problem dieser Arbeit geht es um die Kombination der verschiedenen Methoden zur simultanen Bestimmung von dynamischen und strukturellen Eigenschaften eines kompletten Katalysezyklus. Die Untersuchung erfolgte mittels zeitaufgelöster Resonanz-Raman-Spektroskopie, deren Spektren nicht nur einen Überblick über den zeitlichen Verlauf des Prozesses liefern, sondern die Identifizierung intermediär gebildeter Zustände erlauben. Für die Analyse wurde zusätzlich ein mathematisches Verfahren der simultanen Bestimmung von Komponenten und ihrer Kinetik angewandt und die Ergebnisse denen der vorangegangen Methoden gegenübergestellt

Chemometric analysis strategies for Raman spectroscopic data

Gegenstand dieser Arbeit sind chemometrische Methoden zur Analyse komplexer Datensätze, die mittels Raman-Spektroskopie erzeugt werden. Anhand exemplarischer Problemstellungen werden geeignete Strategien zur Dechiffrierung der chemischen und physikalischen Informationen eines biologischen oder chemischen Systems aus experimentellen Spektren dargestellt und bewertet. Gemeinsames Ziel der verwendeten methodischen Ansätze ist die Bestimmung der Eigenspektren der zum System gehörigen Spezies (Komponentenanalyse). Die so gewonnenen Komponentenspektren dienen dann der Bestimmung der quantitativen Verteilung zwischen den Spezies bzw. struktureller, thermodynamischer oder kinetischer Zusammenhänge. Die Arbeit zeigt die Vielfalt der Einsatzmöglichkeiten der quantitativen Spektrenanalyse und ihrer computergestützten Automatisierung. Am Beispiel der Qualitätskontrolle von Kaffeebohnen wurde gezeigt, dass zur qualitativen und quantitativen Unterscheidung zweier Spezies schon ein singulärer spektraler Marker ausreichend sein kann, dessen Natur nicht notwendigerweise bekannt sein muss. Durch den Einsatz algorithmischer Verfahren kann die Kontrolle statistisch aussagekräftiger Stichproben beschleunigt werden. Die Raman-Spektroskopie ermöglicht jedoch nicht nur die Unterscheidung von Spezies sondern auch ihre strukturelle Charakterisierung. Am Beispiel des biologischen Photorezeptors Rhodopsin werden Möglichkeiten der Strukturbestimmung bei strukturell variablen Systemen aufgezeigt und diskutiert. Die Ermittlung der Komponentenspektren von Spezies, die in einem Gleichgewicht vorliegen, eröffnet die Bestimmung thermodynamischer Zustandsgrößen. Als Beispiel wurden dazu die Raman-Spektren eines prototypischen Phytochroms temperaturabhängig gemessen und verschiedene Methoden der Datenanalyse vorgestellt und diskutiert. Im letzten und gleichzeitig komplexesten Problem dieser Arbeit geht es um die Kombination der verschiedenen Methoden zur simultanen Bestimmung von dynamischen und strukturellen Eigenschaften eines kompletten Katalysezyklus. Die Untersuchung erfolgte mittels zeitaufgelöster Resonanz-Raman-Spektroskopie, deren Spektren nicht nur einen Überblick über den zeitlichen Verlauf des Prozesses liefern, sondern die Identifizierung intermediär gebildeter Zustände erlauben. Für die Analyse wurde zusätzlich ein mathematisches Verfahren der simultanen Bestimmung von Komponenten und ihrer Kinetik angewandt und die Ergebnisse denen der vorangegangen Methoden gegenübergestellt.The aim of this thesis is the use of chemometric methods for the analysis of complex data sets that are generated by Raman spectroscopy. On the basis of selected examples, suitable strategies for deciphering the chemical and physical information of a biological or chemical system from experimental spectra are presented and evaluated. Common objective of the methods is the determination of the \textit{Eigen}-spectra of the species of the respective system (component analysis). The component spectra obtained in this way constitute the basis for analyzing the distribution of the species involved as well as their structural, thermodynamic, or kinetic relationships. The present work documents the manifold of applications of the quantitative spectra analysis and its computer-assisted automation. Using the example of quality control of coffee beans, it is shown that for qualitatively and quantitatively distinguishing between two species, a single spectral marker may be sufficient, even if its nature is unknown. Through the use of algorithmic methods the control of statistically meaningful number of samples could be accelerated. However, Raman spectroscopy allows not only the differentiation of species, but also their structural characterization. The example of the biological photoreceptor rhodopsin demonstrates the possibilities for structure analysis in structural variable systems. The determination of the component spectra of the species involved in an equilibrium then allows for evaluating thermodynamic parameters. This is demonstrated on the basis of Raman spectra of a prototypical phytochrome, measured as a function of the temperature. Various methods of data analysis are presented to determine thermodynamic variables of the system. The last and most complex problem of this work refers to the simultaneous determination of the dynamic and structural properties of a complete catalytic cycle. The investigation was carried out by means of time-resolved resonance Raman spectroscopy, the spectra of which not only provide an overview of the temporal evolution of the process but also allow for identifying intermediately formed states. For the analysis, a mathematical method for the simultaneous determination of components and their kinetics was applied and the results compared with the previous methods

Example for the creation of a Digital Calibration Certificate (DCC) in XML and PDF/A-3 for people who start working with DCCs

<p>This software and data provides a simple example for the creation of Digital Calibration Certificates in XML and PDF/A-3 format for the temperature measurement quantity. It is of educational purpose and shows simple ways how to create DCCs to people who are new to this field. It is demonstrating the technology and not caliming to represent a full calibration certificate.</p> <p>The work was part of EMPIR project 21SCP01 (DCC2GO).</p>This project (21SCP01, DCC2GO) has received funding from the EMPIR programme co-financed by the Participating States and from the European Union's Horizon 2020 research and innovation programme

Freely available, Digital Calibration Certificates (DCC) training compendium of basic knowledge for stakeholders with no prior knowledge of DCCs, with particular focus on the SEND community and supporting a harmonised level of basic DCC knowledge within the European metrology community

<p>These technical documents provide a structured and easy-to-understand information material for a clear understanding of Digital Calibration Certificate (DCC), their benefits and necessary requirements. It can be used by stakeholders with no prior knowledge of DCCs to gain basic knowledge on DCCs. This DCC training compendium should be suitable for a wide range of stakeholders with particular focus on the community of small and emerging National Metrology Institutes and Designated Institutes.</p> <p>The work is deliverable D1 of EMPIR project 21SCP01 (DCC2GO).</p>This project (21SCP01, DCC2GO) has received funding from the EMPIR programme co-financed by the Participating States and from the European Union's Horizon 2020 research and innovation programme

Electrochemical and Resonance Raman Spectroscopic Studies of Water-Oxidizing Ruthenium-Terpyridyl-Bipyridyl Complexes

The irreversible conversion of single-site water oxidation catalysts (WOC) into the more rugged catalysts structurally related to [(trpy)(5,5&rsquo;-X2-bpy)RuIV(&mu;-O)RuIV(trpy)(O)(H2O)]4+ (X = H, 1-dn4+; X = F, 2-dn4+) represents a critical issue in developing active and durable WOC. In this work, the electrochemical and acid-base properties of 1-dn4+ and 2-dn4+ were evaluated. In-situ resonance Raman spectroscopy was employed to characterize species formed upon stoichiometric oxidation of single-site catalysts demonstrating the formation of high oxidation states mononuclear Ru=O and RuO-O complexes. Under turnover conditions, the dinuclear intermediates, 1-dn4+ and 2-dn4+, as well as the previously proposed [RuVI(trpy)(O)2(H2O)]2+ complex (32+) are formed. 32+ is a pivotal intermediate that provides access to the formation of dinuclear species. Single crystal X-ray diffraction analysis of the isolated complex [RuIV(O)(trpy)(5,5&rsquo;-F2-bpy)]2+ reveals a clear elongation of the Ru-N bond located in the trans position to the oxo group, documenting the weakness of this bond which promotes the release of the bpy ligand and the subsequent formation of 32+. &nbsp;</p

Light–Dark Adaptation of Channelrhodopsin Involves Photoconversion between the all-<i>trans</i> and 13-<i>cis</i> Retinal Isomers

Channelrhodopsins (ChR) are light-gated ion channels of green algae that are widely used to probe the function of neuronal cells with light. Most ChRs show a substantial reduction in photocurrents during illumination, a process named “light adaptation”. The main objective of this spectroscopic study was to elucidate the molecular processes associated with light–dark adaptation. Here we show by liquid and solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy that the retinal chromophore of fully dark-adapted ChR is exclusively in an all<i>-trans</i> configuration. Resonance Raman (RR) spectroscopy, however, revealed that already low light intensities establish a photostationary equilibrium between all<i>-trans</i>,15<i>-anti</i> and 13<i>-cis</i>,15-<i>syn</i> configurations at a ratio of 3:1. The underlying photoreactions involve simultaneous isomerization of the C(13)C(14) and C(15)N bonds. Both isomers of this DA_app state may run through photoinduced reaction cycles initiated by photoisomerization of only the C(13)C(14) bond. RR spectroscopic experiments further demonstrated that photoinduced conversion of the apparent dark-adapted (DA_app) state to the photocycle intermediates P500 and P390 is distinctly more efficient for the all-<i>trans</i> isomer than for the 13-<i>cis</i> isomer, possibly because of different chromophore–water interactions. Our data demonstrating two complementary photocycles of the DA_app isomers are fully consistent with the existence of two conducting states that vary in quantitative relation during light–dark adaptation, as suggested previously by electrical measurements