Heterogeneity in the processing of ClC-5 mutants related to Dent disease

International audienceMutations in the electrogenic Cl-/H+ exchanger ClC-5 gene CLCN5 are frequently associated with Dent disease, an X-linked recessive disorder affecting the proximal tubules. Here, we investigate the consequences in X. laevis oocytes and in HEK293 cells of 9 previously reported, pathogenic, missense mutations of ClC-5, most of them which are located in regions forming the subunit interface. Two mutants trafficked normally to the cell surface and to early endosomes, and displayed complex glycosylation at the cell surface like wild-type ClC 5, but exhibited reduced currents. Three mutants displayed improper N-glycosylation, and were non-functional due to being retained and degraded at the endoplasmic reticulum. Functional characterization of four mutants allowed us to identify a novel mechanism leading to ClC-5 dysfunction in Dent disease. We report that these mutant proteins were delayed in their processing and that the stability of their complex glycosylated form was reduced, causing lower cell surface expression. The early endosome distribution of these mutants was normal. Half of these mutants displayed reduced currents, whereas the other half showed abolished currents. Our study revealed distinct cellular mechanisms accounting for ClC-5 loss-of-function in Dent disease

Analyse fonctionnelle de nouvelles mutations pathogènes du canal chlorure CLC-KB impliquées dans le syndrome de Bartter

Bartter's syndrome type III results from loss-of-function mutations in the CLCNKB gene that encodes the CLC-KB chloride channel. To date, few CLCNKB mutations have been fully functionally investigated. In this study, we have investigated the functional consequences of novel CLCNKB mutations (collected by the Department of Genetics of the European Georges Pompidou Hospital) in Xenopus laevis oocytes, HEK293T and MDCK cells, in terms of electrical activity and surface expression. We have demonstrated that all mutations decreased plasma membrane expression and conductance of CLC-KB in similar proportions, indicating that altered cell surface expression is the main functional defect caused by CLCNKB mutations. However, some mutations also alter external pH and calcium sensitivity. The physiological relevance of these regulations is open to question, but clearly, their alteration could have a pathological impact. In conclusion, this functional study highlights the essential role of CLC-KB in the preservation of sodium balance and provides new clues for finding specific therapeutic drugs that would be able to restore sufficient function of CLC-KB in patients with Bartter's syndrome type III. Moreover, functional analysis of mutations is an extremely powerful tool for structure-function studies. In association with the search of new partners, it should allow discovering the physiological regulations of this channel that are almost unknown.Le syndrome de Bartter de type III résulte de mutations du gène CLCNKB codant le canal chlorure CLC-KB. Un grand nombre de mutations a été répertorié, mais peu d'entre elles ont été caractérisées fonctionnellement. Devant ce manque de données, nous nous sommes fixés comme objectif de procéder à une analyse fonctionnelle des mutations de CLCNKB pour tenter d'approfondir davantage les mécanismes de régulation de CLC-KB. Ce travail a nécessité l'emploi de trois systèmes d'expression hétérologue, les ovocytes de Xenopus laevis et les lignées cellulaires rénales HEK293T et MDCK, afin de procéder à des analyses électrophysiologiques et des expériences de biologie cellulaire. Nous démontrons que toutes les mutations étudiées altèrent l'expression membranaire de la protéine et que la conductance résiduelle est proportionnée à cette expression. Ainsi, la réduction des courants provient d'une réduction du nombre de canaux et non d'une altération majeure de la conduction ou de la régulation. Nous rapportons également que certaines mutations modifient la sensibilité au pH et au calcium extracellulaires du CLC-KB. Cette altération peut avoir un impact pathologique majeur. En conclusion, cette étude fonctionnelle montre le rôle essentiel du CLC-KB dans le maintien de la balance sodée et laisse entrevoir un espoir thérapeutique à long terme de restauration des anomalies précisément identifiées. Enfin, l'analyse de mutations est un outil extrêmement puissant pour les études structure-fonction. Associée à la recherche de nouveaux partenaires, elle devrait permettre de découvrir les régulations physiologiques de ce canal, pour l'heure presqu'inconnues

Analyse fonctionnelle de nouvelles mutations pathogènes du canal chlorure CLC-KB impliquées dans le syndrome de Bartter

Le syndrome de Bartter de type III résulte de mutations du gène CLCNKB codant le canal chlorure CLC-KB. Un grand nombre de mutations a été répertorié, mais peu d entre elles ont été caractérisées fonctionnellement. Devant ce manque de données, nous nous sommes fixés comme objectif de procéder à une analyse fonctionnelle des mutations de CLCNKB pour tenter d approfondir davantage les mécanismes de régulation de CLC-KB. Ce travail a nécessité l emploi de trois systèmes d expression hétérologue, les ovocytes de Xenopus laevis et les lignées cellulaires rénales HEK293T et MDCK, afin de procéder à des analyses électrophysiologiques et des expériences de biologie cellulaire. Nous démontrons que toutes les mutations étudiées altèrent l expression membranaire de la protéine et que la conductance résiduelle est proportionnée à cette expression. Ainsi, la réduction des courants provient d une réduction du nombre de canaux et non d une altération majeure de la conduction ou de la régulation. Nous rapportons également que certaines mutations modifient la sensibilité au pH et au calcium extracellulaires du CLC-KB. Cette altération peut avoir un impact pathologique majeur. En conclusion, cette étude fonctionnelle montre le rôle essentiel du CLC-KB dans le maintien de la balance sodée et laisse entrevoir un espoir thérapeutique à long terme de restauration des anomalies précisément identifiées. Enfin, l analyse de mutations est un outil extrêmement puissant pour les études structure-fonction. Associée à la recherche de nouveaux partenaires, elle devrait permettre de découvrir les régulations physiologiques de ce canal, pour l heure presqu inconnues.Bartter s syndrome type III results from loss-of-function mutations in the CLCNKB gene that encodes the CLC-KB chloride channel. To date, few CLCNKB mutations have been fully functionally investigated. In this study, we have investigated the functional consequences of novel CLCNKB mutations (collected by the Department of Genetics of the European Georges Pompidou Hospital) in Xenopus laevis oocytes, HEK293T and MDCK cells, in terms of electrical activity and surface expression. We have demonstrated that all mutations decreased plasma membrane expression and conductance of CLC-KB in similar proportions, indicating that altered cell surface expression is the main functional defect caused by CLCNKB mutations. However, some mutations also alter external pH and calcium sensitivity. The physiological relevance of these regulations is open to question, but clearly, their alteration could have a pathological impact. In conclusion, this functional study highlights the essential role of CLC-KB in the preservation of sodium balance and provides new clues for finding specific therapeutic drugs that would be able to restore sufficient function of CLC-KB in patients with Bartter s syndrome type III. Moreover, functional analysis of mutations is an extremely powerful tool for structure-function studies. In association with the search of new partners, it should allow discovering the physiological regulations of this channel that are almost unknown.PARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Orally Active Aminopeptidase A Inhibitor Prodrugs: Current State and Future Directions

International audiencePURPOSE OF REVIEW:To review the data supporting the use of aminopeptidase A (APA) inhibitor prodrugs as centrally acting antihypertensive agents.RECENT FINDINGS:Brain renin-angiotensin system (RAS) hyperactivity has been implicated in the development and maintenance of hypertension. Angiotensin III, generated by APA, one of the main effector peptides of the brain RAS, exerts a tonic stimulatory control over blood pressure in hypertensive rats. This identified brain APA as a potential therapeutic target for the treatment of hypertension, leading to the development of RB150/firibastat, an orally active prodrug of the specific and selective APA inhibitor, EC33. When given orally, RB150/firibastat crosses the gastrointestinal and blood-brain barriers, enters the brain, and generates two active molecules of EC33 which inhibit brain APA activity, blocking brain angiotensin III formation, and decrease blood pressure for several hours in hypertensive rats. Orally active APA inhibitor prodrugs, by blocking brain RAS activity, represent promising novel strategy for treating hypertension

Venom peptides: emergent biological tools for lung cancer imaging

International audienc

Les peptides de venins : des outils biologiques émergents pour l'imagerie du cancer pulmonaire

National audienceDe nombreux cancers, incluant les cancers pulmonaires non à petites cellules (CPNPC), sont associés à une perturbation des mécanismes due à un disfonctionnement et/ou une surexpression de nombreux canaux ioniques tels que certains sous-types de canaux sodium (Na V 1.7), potassium (K Ca 3.1), de canaux ASIC (acid sensing ion channels) ou encore de récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (nAChrα7, nAChrα9/α10). Bien que les approches d’imagerie (radiographie, CT-scan, TEP-scan) soient couramment utilisées dans la caractérisation des cancers pulmonaires, certaines limitations nécessitent le développement de nouvelles sondes d’imagerie plus spécifiques des cibles moléculaires surexprimées au sein des adénocarcinomes pulmonaires. Les toxines peptidiques sont connues pour agir sélectivement et avec une forte affinité sur certains canaux ioniques surexprimés dans les cellules cancéreuses. Le développement de nouveaux agents d’imagerie des CPNPC consistera donc à exploiter les propriétés pharmacologiques des toxines peptidiques et s’articulera autour de trois axes de recherche : (1) la synthèse chimique de ces toxines permettant leur marquage par chimie « click », à l’aide de sondes fluorescentes ou radioactives, (2) la validation fonctionnelle des toxines marquées à l’aide de techniques électrophysiologiques afin de s’assurer du maintien de leurs propriétés pharmacologiques, et (3) la preuve de concept par l’imagerie in vitro de lignées d’adénocarcinomes et in vivo de souris xénogreffées afin de valider la spécificité et la qualité des toxines marquées. La mambalgine, toxine ciblant les canaux ASICs a été synthétisé avec et sans fluorochrome. La surexpression des protéines Na V 1.7, α7 et α9 dans les lignées cellules cancéreuses pulmonaires ont été validé. De plus, des acquisitions microscopiques avec les toxines marquées ont validé leur expression membranaire. Ces résultats encouragent le couple toxine marquée/ canal ionique comme outil d’imagerie pour le cancer pulmonaire

Venom peptides: emergent biological tools for lung cancer imaging

National audienceMany cancers, including non-small cell lung cancer (NSCLC), are associated with disrupted mechanisms due to dysfunction and/or overexpression of numerous ion channels such as certain subtypes of sodium (NaV1.7) and potassium (KCa3.1) channels, ASICs (acid sensing ion channels) or nicotinic acetylcholine receptors (α7, α9/α10). In particular, the activation of these ion channels plays an important role in cancer cell aggressiveness and tumor invasion1, their overexpression seeming to be correlated with the appearance of metastases. Although imaging approaches (radiography, CTscan for computed tomography scanning, PET-scan for positron emission tomography) are commonly used in the anatomical characterization of NSCLC, some limitations require the development of new imaging probes more specific of overexpressed molecular targets lung adenocarcinomas2. Peptide toxins are known to act selectively and with high affinity on certain ion channels overexpressed in cancer cells. The development of new imaging agents for NSCLC will therefore involve exploiting the pharmacological properties of peptide toxins, and will focus on three research areas : (1) the chemical synthesis of these toxins enabling them to be labelled by "click" chemistry, using fluorescent or radioactive probes, (2) the functional validation of labelled toxins using electrophysiological techniques to ensure that their pharmacological properties are maintained, and (3) proof-of-concept through in vitro imaging of adenocarcinoma lines and in vivo imaging of xenografted mice to validate the specificity and quality of labelled toxins. Mambalgine, an ASIC-targeted toxin, was synthesized with and without fluorochrome. The overexpression of NaV1.7, α7 and α9 proteins in lung cancer cell lines was validated. In addition, their membrane expression was also validated by fluorescence microscopy, using the tagged toxins. These preliminary results are highly encouraging for designing the "labeled toxin/ion channel" pair as an imaging tool to detect NSCLC

Venom peptides: promising tools for lung cancer imaging

National audienceMany cancers, and the non-small cell lung cancer (NSCLC) in particular, are associated with significant overexpression of various ion channels such as certain subtypes of sodium, calcium and potassium channels, pH-sensitive channels (ASICs for acid sensing ion channels) or nicotinic acetylcholine receptors. Activation of these ion channels plays an important role in the aggressiveness of cancer cell and tumor invasion, their overexpression seeming to be correlated with the appearance of metastases. Although imaging approaches (radiography, CT-scan for computed tomography scanning, PET-scan for positron emission tomography) are commonly used in the anatomical characterization of lung cancer, some limitations of these approaches require the development of new imaging probes more specific of overexpressed molecular targets in lung adenocarcinomas. Peptide toxins, which possess unique pharmacological properties, are well known to act selectively and with high affinity on certain overexpressed ion channels in cancer cells. Therefore, a promising solution towards the development of new imaging agents oflung cancer biomarkers appears to be the chemical synthesis of these toxins allowing them to be labelled by “click” chemistry using various fluorescent or radioactive probes

Les peptides de venins pour l'imagerie du cancer pulmonaire

International audienceMany cancers, and the non-small cell lung cancer in particular, are associated with a disturbance of the mechanisms controlling ion homeostasis due, especially, to dysfunction and/or overexpression of many ion channels such as certain subtypes of sodium, calcium and potassium channels, pH-sensitive channels (ASICs for acid sensing ion channels) or nicotinic acetylcholine receptors. In particular, the activation of these ion channels plays an important role in cancer cell aggressiveness and tumor invasion, their overexpression seeming to be correlated with the appearance of metastases. While imaging techniques such as chest X-ray, computed tomography (CT) scan, magnetic resonance imaging (MRI), and positron emission tomography (PET) scan are commonly employed for the anatomical characterization of lung cancer, certain limitations necessitate the development of new imaging probes that are more specific to overexpressed molecular targets in lung adenocarcinomas. Some of these ionic channels can be potent biomarker of interest for lung cancer if some specific ligand associated with medical imaging can be explored. Peptide toxins, which have unique pharmacological properties, are well known to act selectively and with high affinity on these ion channels. Therefore, a promising solution towards the development of new lung cancer biomarkers appears to be the chemical synthesis of these toxins allowing them to be labeled by “click” chemistry using various fluorescent or radioactive probes.De nombreux cancers, et le cancer pulmonaire non à petites cellules en particulier, sont associés à une perturbation des mécanismes contrôlant l'homéostasie ionique. Ceci est dû notamment à un dysfonctionnement et/ou une surexpression de nombreux canaux ioniques tels que certains sous-types de canaux sodiques, calciques et potassiques, de canaux sensibles au pH (ASIC pour Acid Sensitive Ion Channels) ou encore de récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine. En particulier, l’activation de ces canaux ioniques joue un rôle important dans l’agressivité des cellules cancéreuses et l’invasion tumorale, leur surexpression semblant être corrélée avec l’apparition de métastases. Bien que des techniques d'imagerie médicale telles que la radiographie, la tomodensitométrie (TDM), l’imagerie par résonnance magnétique (IRM) ou la tomographie par émission de positons (TEP), soient couramment utilisées dans la caractérisation anatomique et métabolique du cancer pulmonaire, certaines de leurs limitations nécessitent le développement de nouvelles sondes d’imagerie plus spécifiques des cibles moléculaires surexprimées au sein des adénocarcinomes pulmonaires. Certains de ces canaux ioniques sembleraient être d’excellents biomarqueurs du cancer du poumon, à condition de pouvoir les détecter et les quantifier le plus précocement possible. Les toxines peptidiques, qui ont des propriétés pharmacologiques uniques, sont bien connues pour cibler sélectivement et avec une forte affinité ces canaux ioniques. L’évaluation de ces biomarqueurs du cancer pulmonaire serait possible grâce à une synthèse chimique et un marquage maitrisé par chimie "click"de ces peptides avec des sondes fluorescentes ou radioactives

Cardiac inflammatory CD11b/c cells exert a protective role in hypertrophied cardiomyocyte by promoting TNFR2- and Orai3- dependent signaling

International audienceAbstract Early adaptive cardiac hypertrophy (EACH) is initially a compensatory process to optimize pump function. We reported the emergence of Orai3 activity during EACH. This study aimed to characterize how inflammation regulates store-independent activation of Orai3-calcium influx and to evaluate the functional role of this influx. Isoproterenol infusion or abdominal aortic banding triggered EACH. TNFα or conditioned medium from cardiac CD11b/c cells activated either in vivo [isolated from rats displaying EACH], or in vitro [isolated from normal rats and activated with lipopolysaccharide], were added to adult cardiomyocytes before measuring calcium entry, cell hypertrophy and cell injury. Using intramyocardial injection of siRNA, Orai3 was in vivo knockdown during EACH to evaluate its protective activity in heart failure. Inflammatory CD11b/c cells trigger a store-independent calcium influx in hypertrophied cardiomyocytes, that is mimicked by TNFα. Pharmacological or molecular (siRNA) approaches demonstrate that this calcium influx, depends on TNFR 2 , is Orai3-driven, and elicits cardiomyocyte hypertrophy and resistance to oxidative stress. Neutralization of Orai3 inhibits protective GSK3β phosphorylation, impairs EACH and accelerates heart failure. Orai3 exerts a pathophysiological protective impact in EACH promoting hypertrophy and resistance to oxidative stress. We highlight inflammation arising from CD11b/c cells as a potential trigger of TNFR 2 - and Orai3-dependent signaling pathways