Production of recombinant antibody fragments in Bacillus megaterium

Rekombinante Antikörper und Antikörperfragmente sind wichtige Hilfsmittel für die Forschung, Diagnostik und Therapie. Seit zwanzig Jahren wird E. coli für die Produktion rekombinanter Antikörperfragmente eingesetzt. Als gramnegatives Bakterium mit einer äußeren Membran weist es jedoch nur eine eingeschränkte Sekretionskapazität für heterologe Proteine auf. Alternative Produktionssysteme, wie grampositive Bakterien, versprechen aufgrund der fehlenden äußeren Membran Vorteile bei der sekretorischen Produktion von Antikörperfragmenten. In dieser Arbeit wurde das grampositive Bakterium B. megaterium für die Produktion und Sekretion von Antikörperfragmenten untersucht. Hierfür wurde der Einfluss von Parametern wie Temperatur, Medium und Produktionsdauer auf die Produktion des anti-Lysozym D1.3 scFv überprüft. Eine Produktionstemperatur von 37 °C – 43 °C, eine Produktionsdauer von 24 h und die Verwendung des reichhaltigen TB-Mediums waren optimal für die scFv-Produktion. Mit den optimierten Produktionsparametern konnten der D1.3 scFv und der anti-CRP LA13-IIE3 scFv in B. megaterium produziert und anschließend aufgereinigt werden. Die Ausbeuten aus den B. megaterium- und E. coli-Produktionen waren vergleichbar. Die in B. megaterium produzierten scFvs zeigten jedoch eine höhere spezifische Aktivität. Der Antikörper D1.3 konnte auch im neuartigen scFabDeltaC-Format in B. megaterium produziert werden. Die aus der B. megaterium-Produktion erzielte Ausbeute war nur wenig geringer als die Ausbeute aus der E. coli-Produktion. Die spezifische Aktivität der aufgereinigten scFabDeltaC-Fragmente war jedoch identisch. In B. megaterium konnte erstmals neben scFv-Fragmenten auch ein scFabDeltaC-Fragment erfolgreich sekretorisch produziert werden. Damit stellt B. megaterium ein alternatives, prokaryotisches Produktionssystem für Antikörperfragmente mit viel Entwicklungspotential dar.Recombinant antibodies and antibody fragments are important tools for research, diagnostic and therapy. Since twenty years E. coli have been used for the production of recombinant antibody fragments. As a Gram-negative bacterium with an outer membrane it possesses a limited secretory capacity for heterologous proteins. Alternative production systems like Gram-positive bacteria have advantages concerning the secretory production of antibody fragments, because they are lacking an outer membrane. In this work the Gram-positive bacterium B. megaterium was tested for the production and secretion of antibody fragments. For this purpose the influence of the parameters temperature, medium and production time on the production of the anti-lysozyme D1.3 scFv were investigated. A production temperature of 37 °C – 43 °C, a production time of 24 h and the usage of the rich TB medium were optimal for scFv production. Using these optimized production parameters the D1.3 scFv and the anti-CRP LA13-IIE3 scFv were produced in B. megaterium and purified afterwards. The yields of the B. megaterium and E. coli productions were comparable, but the scFvs produced in B. megaterium showed a higher specific activity. The antibody D1.3 was also produced in the novel scFabDeltaC format in B. megaterium. The yield of the B. megaterium production was little lower than the yield of the E. coli production. The specific activity of the purified scFabDeltaC fragments was identical. For the first time scFv fragments and a scFabDeltaC fragment were successfully produced and secreted in B. megaterium. For this reason B. megaterium is an alternative, prokaryotic production system for antibody fragments with a great potential for further improvement