大腸菌を用いたフォスファカン（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の融合コア蛋白の発現条件の検討

Optimal conditions for expressing a specific region of core protein of phosphacan, a chondroitin sulfate proteoglycan known as receptor type protein tyrosine phosphatase, as fusion protein with glutathione S-transferase (GST) in E.coli were examined. DNA fragments inserted into the expression vector (pGEX-4T-1) were amplified by RT-PCR using mRNA purified from E18 rat brain as template. Primers attached with BamH I or EcoR I restriction site on 5' end were used to amplify first strand cDNA by PCR. Before ligation into the pGEX-4T-1 for GST fusion protein, PCR products were once cloned using T-A cloning system because they were not directly ligated into the pGEX-4T-1. E.coli strain BL21 was transformed by pGEX-4T-1 ligated with restriction DNA fragment cut out from pCR II plasmid vector of T-A clonig system. The growth of transformed BL21 was not different between the colony incubated at 37℃ for 24-48h and the colony stored at 4℃ for 7-10 days after 24h incubation at 37℃. The desirable OD(550) of culture medium for inducing the expression of fusion protein by isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) was from 0.6 to 1.0, because expression of native E.coli proteins per ml of culture medium was increased relatively when IPTG was added at OD(550) more than 1.0. The expression of fusion protein reached plateau around 6h after the induction. Relative expression of native E.coli proteins per ml of culture medium increased thereafter. Therefore, it may be desirable to purify the fusion protein around 6h after the induction.コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一種であるフォスフォアカンのコア蛋白の特異領域を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白として大腸菌内で発現させ、その発現条件の検討を行った。胎生18日目のラット脳から抽出したmRNAを鋳型として、RT－PCRによって増幅したDNAフラグメントを発現ベクターに挿入した。PCRの為のプライマーは、BamH IとEcoR Iの酵素消化部位を5'末端に組み込んだものを用いた。GST融合蛋白を作製するために、PCR産物を一旦、T-Aクローニングシステムに組込み、その後プラスミド精製と制限酵素消化によって目的のフラグメントを切り出した後、pGEXベクターに再度組み込ませ、大腸菌（BL21）を形質転換した。形質転換した大腸菌（BL21）について、24～48時間培養後に、37℃で保存したものと、37℃で24時間培養後に4℃で7～10日間保存したものとの増殖曲線を比較したところ、両者に有意な差は認められなかった。融合蛋白の誘導に必要なイソプロピルチオ－β－D－ガラクトシド（IPTG）の添加の時期は、菌培養液の吸光度（550nm）が1.0以上の場合には融合蛋白に比べて他の大腸菌固有の蛋白の割合が相対的に増大してしまう為、また、吸光度が0.6以下では菌量が少ない為、吸光度が0.6～1.0を示す時期に添加する方がより望ましいことがわかった。IPTGによる誘導後、融合蛋白の発現は6時間でプラトーに達し、その後は大腸菌固有の内在蛋白量の割合が相対的に増加した。以上の結果より、融合蛋白の発現を誘導するための至適条件は次のように決定された。1. IPTG誘導は、培養液の吸光度（550nm）が0.6～1.0の際に開始する。2. IPTGによる誘導時間は、6時間とする

ヒスチジンタグを持つホスファカンコア蛋白の大腸菌での発現と精製

Specific regions of core protein of phosphacan, one of the chondroitin sulfate proteoglycans, were expressed as fusion proteins with histidine-tag (His-tag) in Escherichia coli (E.coli) and were affinity purified using nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) matrix. cDNA fragments encoding amino acid residues 343-446 (P3) and 1-340 (P4) of phosphacan core protein were amplified by polymerase chain reaction from E18 rat brain mRNA as template. The amplified products were subcloned into pQE30 vector and were introduced into E.coli strain M15 [pREP4] for the expression. The His-tagged fusion proteins were expressed by cultivating the transformants at 37℃ for 5h in the presence of 1mM IPTG. His-tagged P3 fusion protein (His-P3) was expressed as soluble form, and was purified using Ni-NTA matrix. His-tagged P4 fusion protein (His-P4) which was sequestered into insoluble inclusion bodies was treated with 8.0M urea to solubilize, and then was purified under denaturing conditions.コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一つであるホスファカンのコア蛋白の特定領域を,ヒスチジンタグ(His-tag)を持つ融合蛋白として大腸菌内で発現させニッケル-ニトリロ3酢酸(Ni-NTA)アフィニティ担体を用いて精製した｡ホスファカンコア蛋白のアミノ酸残基343-446(P3)及び1-340(P4)に相当するcDNA断片を,胎性18日目のラット脳由来のmRNAを鋳型としたPCRによって増幅した｡増幅された断片は発現ベクターpQE30に組み込まれ,これで大腸菌(M15[pREP4])を形質転換した｡His-tag融合蛋白の発現は形質転換株を1mM IPTG存在下で37℃,5時間培養することによって行われた｡His-tagged P3融合蛋白は可溶性蛋白質として発現し,Ni-NTA担体を用いて精製された.His-tagged P4融合蛋白は不溶性の封入体を形成したが,8M尿素によって可溶化され,変性条件下で同様に精製された

ヒト血清リポタンパク質とシクロデキストリンのアガロースゲル内における相互作用

Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides with low molecular weight. They have been known to bind to some serum lipoproteins and to form complexes. To elucidate whether each serum lipoprotein subclass could be separated by electrophoresis using CDs, we performed preliminary experiment, in which lipoprotein-CDs interaction was examined on electrophoresis with agarose gel. When the supporting agarose gel containing both α-CD and β-CD was prepared and was applied to isoelectric focusing for fractionating serum lipoproteins, apoB lipoproteins were found to be clearly separated into several fractions on this electrophoresis. This finding suggested that apoB lipoprotein may be detected as isolated form by arranging amounts of added CDs.シクロデキストリンは低分子量の環状オリゴ糖で, リポタンパク質と複合体を形成する｡シクロデキストリンを使用した電気泳動による血清リポタンパク質サブクラスの分離の可能性を明らかにするために, リポタンパク質とシクロデキストリンとの泳動用ゲル内での相互作用について検討をおこなった｡その結果,α-CDとβ-CDの2種類のCDをアガロースゲルに添加し,このゲルを泳動用支持体として等電点電気泳動をおこなったところ,apoB含有リポタンパク質が数分画分離された｡したがって,ゲル内へのシクロデキストリンの適正な添加条件が設定できるならば,apoB含有リポタンパク質サブクラスの分離が可能となることが示唆された

A study on recording and analysis conditions of polysomnography for automated computer analysis of sleep stages.

自動解析装置を用いて終夜睡眠ポリグラフを解析する際の記録条件と解析条件を検討した。対象は若年成人女性10名で,解析には0xford社製睡眠ポリグラフ記録･解析装置Medilog SAC 847 Systemを用い,第3夜の記録を視察判定と比較した｡徐波睡眠の指標となるδ波の最小振幅基準を初期設定の基線から±31/μVと,これより低い±25/μVに設定すると,徐波睡眠量,徐波睡眠率とも視察による判定とほぼ同じ解析結果が得られた。眼球運動の入力感度はREM睡眠量,REM睡眠率に影響しなかったが,オトガイ筋電図の入力感度を初期設定の1.5VにするとREM睡眠がほとんどみれなくなる例が多く,1.0VではREM睡眠量がこれまでの報告より少ないものの,視察判定に近い結果が得られた｡以上の研究結果から,我々が用いた自動解析装置では,オトガイ筋電図の入力感度を1.0V,δ波の最小振幅基準を±25～31/μVに設定すれば,視察判定とほぼ同じ解析結果が得られると考えられた｡Recording and analysis conditions of polysomnography were examined in 10 young adult female by using sleep analysis computer Medilog SAC 847 system (Oxford). The quantity and percentage of slow wave sleep were consistent with those of visual inspection when the minimum delta amplitude was adjusted at ± 25～31μV from the baseline. The gain amplitude of mandibular electromyogram dramatically affected recognition of REM stage by the computer. Percentage of REM sleep was almost same as that of visual inspection when the gain potentiometer was adjusted to read 50μV peak-to-peak calibration signal as 1.0V, while REM stage was not recognized when　the gain potentiometer was adjusted to 1.5V. In contrast, the gain amplitude of electropthalmogram　did not affect the recognition of REM stage

Expression of Phosphacan, a chondroitin sulfate proteoglycan, core protein in Esherichia coli as a fusion protein with glutathione S-transferase

Optimal conditions for expressing a specific region of core protein of phosphacan, a chondroitin sulfate proteoglycan known as receptor type protein tyrosine phosphatase, as fusion protein with glutathione S-transferase (GST) in E.coli were examined. DNA fragments inserted into the expression vector (pGEX-4T-1) were amplified by RT-PCR using mRNA purified from E18 rat brain as template. Primers attached with BamH I or EcoR I restriction site on 5' end were used to amplify first strand cDNA by PCR. Before ligation into the pGEX-4T-1 for GST fusion protein, PCR products were once cloned using T-A cloning system because they were not directly ligated into the pGEX-4T-1. E.coli strain BL21 was transformed by pGEX-4T-1 ligated with restriction DNA fragment cut out from pCR II plasmid vector of T-A clonig system. The growth of transformed BL21 was not different between the colony incubated at 37℃ for 24-48h and the colony stored at 4℃ for 7-10 days after 24h incubation at 37℃. The desirable OD(550) of culture medium for inducing the expression of fusion protein by isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) was from 0.6 to 1.0, because expression of native E.coli proteins per ml of culture medium was increased relatively when IPTG was added at OD(550) more than 1.0. The expression of fusion protein reached plateau around 6h after the induction. Relative expression of native E.coli proteins per ml of culture medium increased thereafter. Therefore, it may be desirable to purify the fusion protein around 6h after the induction.コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一種であるフォスフォアカンのコア蛋白の特異領域を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白として大腸菌内で発現させ、その発現条件の検討を行った。胎生18日目のラット脳から抽出したmRNAを鋳型として、RT－PCRによって増幅したDNAフラグメントを発現ベクターに挿入した。PCRの為のプライマーは、BamH IとEcoR Iの酵素消化部位を5'末端に組み込んだものを用いた。GST融合蛋白を作製するために、PCR産物を一旦、T-Aクローニングシステムに組込み、その後プラスミド精製と制限酵素消化によって目的のフラグメントを切り出した後、pGEXベクターに再度組み込ませ、大腸菌（BL21）を形質転換した。形質転換した大腸菌（BL21）について、24～48時間培養後に、37℃で保存したものと、37℃で24時間培養後に4℃で7～10日間保存したものとの増殖曲線を比較したところ、両者に有意な差は認められなかった。融合蛋白の誘導に必要なイソプロピルチオ－β－D－ガラクトシド（IPTG）の添加の時期は、菌培養液の吸光度（550nm）が1.0以上の場合には融合蛋白に比べて他の大腸菌固有の蛋白の割合が相対的に増大してしまう為、また、吸光度が0.6以下では菌量が少ない為、吸光度が0.6～1.0を示す時期に添加する方がより望ましいことがわかった。IPTGによる誘導後、融合蛋白の発現は6時間でプラトーに達し、その後は大腸菌固有の内在蛋白量の割合が相対的に増加した。以上の結果より、融合蛋白の発現を誘導するための至適条件は次のように決定された。1. IPTG誘導は、培養液の吸光度（550nm）が0.6～1.0の際に開始する。2. IPTGによる誘導時間は、6時間とする

Affinity purification of phosphacan core protein expressed in Escherichia coli as histidine-tagged fusion protein

Specific regions of core protein of phosphacan, one of the chondroitin sulfate proteoglycans, were expressed as fusion proteins with histidine-tag (His-tag) in Escherichia coli (E.coli) and were affinity purified using nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) matrix. cDNA fragments encoding amino acid residues 343-446 (P3) and 1-340 (P4) of phosphacan core protein were amplified by polymerase chain reaction from E18 rat brain mRNA as template. The amplified products were subcloned into pQE30 vector and were introduced into E.coli strain M15 [pREP4] for the expression. The His-tagged fusion proteins were expressed by cultivating the transformants at 37℃ for 5h in the presence of 1mM IPTG. His-tagged P3 fusion protein (His-P3) was expressed as soluble form, and was purified using Ni-NTA matrix. His-tagged P4 fusion protein (His-P4) which was sequestered into insoluble inclusion bodies was treated with 8.0M urea to solubilize, and then was purified under denaturing conditions.コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一つであるホスファカンのコア蛋白の特定領域を,ヒスチジンタグ(His-tag)を持つ融合蛋白として大腸菌内で発現させニッケル-ニトリロ3酢酸(Ni-NTA)アフィニティ担体を用いて精製した｡ホスファカンコア蛋白のアミノ酸残基343-446(P3)及び1-340(P4)に相当するcDNA断片を,胎性18日目のラット脳由来のmRNAを鋳型としたPCRによって増幅した｡増幅された断片は発現ベクターpQE30に組み込まれ,これで大腸菌(M15[pREP4])を形質転換した｡His-tag融合蛋白の発現は形質転換株を1mM IPTG存在下で37℃,5時間培養することによって行われた｡His-tagged P3融合蛋白は可溶性蛋白質として発現し,Ni-NTA担体を用いて精製された.His-tagged P4融合蛋白は不溶性の封入体を形成したが,8M尿素によって可溶化され,変性条件下で同様に精製された

Human serum lipoprotein-cyclodextrin interaction in agarose gel

Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides with low molecular weight. They have been known to bind to some serum lipoproteins and to form complexes. To elucidate whether each serum lipoprotein subclass could be separated by electrophoresis using CDs, we performed preliminary experiment, in which lipoprotein-CDs interaction was examined on electrophoresis with agarose gel. When the supporting agarose gel containing both α-CD and β-CD was prepared and was applied to isoelectric focusing for fractionating serum lipoproteins, apoB lipoproteins were found to be clearly separated into several fractions on this electrophoresis. This finding suggested that apoB lipoprotein may be detected as isolated form by arranging amounts of added CDs.シクロデキストリンは低分子量の環状オリゴ糖で, リポタンパク質と複合体を形成する｡シクロデキストリンを使用した電気泳動による血清リポタンパク質サブクラスの分離の可能性を明らかにするために, リポタンパク質とシクロデキストリンとの泳動用ゲル内での相互作用について検討をおこなった｡その結果,α-CDとβ-CDの2種類のCDをアガロースゲルに添加し,このゲルを泳動用支持体として等電点電気泳動をおこなったところ,apoB含有リポタンパク質が数分画分離された｡したがって,ゲル内へのシクロデキストリンの適正な添加条件が設定できるならば,apoB含有リポタンパク質サブクラスの分離が可能となることが示唆された

PLA2R-positive membranous nephropathy in IgG4-related disease

Abstract Background IgG4-related disease (IgG4-RD) is a fibroinflammatory disease that affects multiple organs, including the pancreas, lacrimal glands, salivary glands, periaortic/retroperitoneum, and kidney. Interstitial nephritis is a typical renal disorder associated with IgG4-RD, but membranous nephropathy is also seen in some cases. Case presentation Herein we report on the case of a 77-year-old male patient with nephrotic syndrome and IgG4-related lung disease. His serum phospholipase A2 receptor (PLA2R) antibody was positive. His renal biopsy specimen was also positive for PLA2R. The renal biopsy specimen showed membranous nephropathy with equal IgG3 and IgG4 immunofluorescence staining and no interstitial nephritis, suggesting IgG4-RD manifesting as membranous nephropathy. Conclusions Nephrotic syndrome caused by membranous nephropathy is sometimes associated with IgG4-RD. In such cases, even if serum PLA2R antibody is positive, it should be considered that the membranous nephropathy may be secondary to IgG4-RD