Caractérisation du complexe générateur d'H2O2 DUOX/DUOXA: étude de son rôle dans la biosynthèse des hormones thyroïdiennes et dans les mécanismes de défense

Les espèces réactives de l’oxygène ont initialement été identifiées comme des produits délétères dérivés du métabolisme aérobie. Il est maintenant accepté que ces espèces sont produites de manière régulée par des enzymes et interviennent dans des fonctions cellulaires telles que la défense immunitaire, la signalisation intracellulaire, la biosynthèse des hormones et la modification de matrice extracellulaire. Les NADPH (Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate) oxydases (NOX) forment une famille d’enzymes transmembranaires capables de former de l’anion superoxyde (O2.-) par transfert d’électrons du NADPH à l’oxygène moléculaire (O2). DUOX1 et DUOX2 sont deux des sept membres composant cette famille qui génèrent directement de l’H2O2 comme produit de réduction de l’O2.Initialement clonés à partir de la thyroïde dans notre laboratoire, les ADNc codant pour les protéines DUOX ont été identifiées dans d’autres tissus, comme par exemple la prostate ou l’épithélium respiratoire où DUOX1 est majoritaire. DUOX2 se retrouve également dans les glandes salivaires, dans la muqueuse rectale et tout le long du tractus digestif. D’autre part, un orthologue de DUOX, appelé Udx1, a été identifié en 2004 au niveau de la membrane ovocytaire chez l’oursin. Dans chacun de ces tissus, l’H2O2 produit par les protéines joue un rôle clef. Le mécanisme d’activation de DUOX dans tous ces tissus n’a été identifié que récemment. En effet, pour être exprimé sous forme active à la surface cellulaire, les protéines DUOX nécessitent un facteur de maturation spécifique. Ces facteurs, appelés DUOXA1 et 2 pour « DUOX activator », suivent l’expression tissulaire de leur DUOX respectif. Nous avons montré que la région COOH-terminale de DUOXA1 est responsable de l’activité génératrice d’H2O2 de DUOX1. DUOX2 peut produire de l’H2O2 ou de l’O2.-. L’extrémité NH2-terminale de DUOXA2 est critique dans cette activité et détermine le type de dérivé oxygéné produit. Dans notre système, DUOXA2 n’est pas détecté à la surface cellulaire, sauf en cas de modification de son extrémité amino-terminale par l’addition d’un épitope. DUOXA1 peut être exprimé à la membrane plasmique mais sa présence n’est pas nécessaire au sein du complexe formé avec DUOX pour que ce dernier soit actif. Les facteurs de maturation jouent donc un rôle de protéine chaperonne, induisant la maturation et la translocation d’une protéine DUOX active à la surface cellulaire. Dans la thyroïde, l’H2O2 produit par les protéines DUOX constitue le cofacteur de la thyroperoxydase catalysant l’oxydation de l’iode et le couplage de sa forme oxydée sur des résidus tyrosines de la thyroglobuline menant in fine à la synthèse des hormones thyroïdiennes T3 et T4 et leur relarguage dans la circulation sanguine. Plusieurs mutations dans le gène DUOX2 ont déjà été décrites chez des patients atteints de dyshormonogenèse transitoire ou permanente. Nous avons mis en évidence qu’une inactivation totale de la protéine DUOX2 était compatible avec un état hypothyroïdien peu sévère et transitoire, indiquant l’intervention probable de DUOX1 dans la synthèse des hormones thyroïdiennes. Le défaut génétique identifié est composé d’une délétion génomique partielle d’un allèle associée à une mutation faux-sens (G1518S) sur l’autre allèle du patient hypothyroïdien. Cette mutation, située dans le site catalytique de l’enzyme, mène à une abolition de l’activité de l’enzyme qui est néanmoins exprimée partiellement à la surface cellulaire. Les messagers des DUOX ont été identifiés récemment dans les tractus digestif et respiratoire. Le rôle joué par l’H2O2 dans ces tissus semble avant tout être un rôle de défense contre les micro-organismes en mettant en jeu la lactoperoxydase oxydant le thiocyanate en composé bactéricide actif. Nous avons montré que l’H2O2 produit par DUOX exerce un effet répulsif sur les bactéries. En effet, l’invasion de cellules CHO exprimant de manière stable DUOX2 et DUOXA2 par Salmonella Typhimurium est diminuée lorsque la production d’H2O2 de ces cellules est stimulée. Cet effet répulsif constituerait un rôle primordial pour DUOX au niveau des muqueuses respiratoire et digestive.Lors de la fertilisation, une explosion respiratoire a lieu et de l’H2O2 est produit. Cet H2O2 fourni à l’ovoperoxydase permettrait la formation d’une enveloppe rigide autour de l’ovocyte, bloquant ainsi l’entrée de spermatozoïdes surnuméraires. Ce phénomène a été largement étudié dans l’ovocyte d’oursin, dans lequel la NADPH oxydase responsable de la production d’H2O2 a été caractérisée: il s’agit de Udx1, l’orthologue de DUOX. Chez les mammifères, le phénomène existe mais le mécanisme est en grande partie inconnu. Nous avons montré que les ARNm des DUOX sont exprimés dans l’ovocyte humain ;ceci nous permet d’émettre l’hypothèse que l’inhibition de la polyspermie chez l’homme pourrait être similaire à celle de l’oursin. Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiquesinfo:eu-repo/semantics/nonPublishe

Duox1 est la source majeure d'H2O2 dans la lignée de thyrocytes de rat PCCl3

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The type of DUOX-dependent ROS production is dictated by defined sequences in DUOXA.

A deliberate generation of ROS is now recognized to be achieved by specific NADPH oxidases (NOX). Dual oxidases (DUOXs) are Ca(2+)-activated NOXs and operate as H(2)O(2)-generators in various tissues. A tight regulation is however required to avoid ROS overproduction that can rapidly be harmful to biological systems. DUOX activator (DUOXA) proteins act as organizing elements for surface expression and activity of the DUOX enzymes. To study DUOX activation by the maturation factors, chimeric DUOXA proteins were generated by replacing particular domains between DUOXA1 and DUOXA2. Their impact on DUOX function and membrane expression were explored in a reconstituted heterologous cell system composed of COS-7 cells. We have shown that the COOH-terminal end of DUOXA1 is responsible for DUOX1-dependent H(2)O(2) generation. The NH(2)-terminal tail of DUOXA2 is critical to specify the type of ROS released by DUOX2, hydrogen peroxide or superoxide. Native DUOXA2 would constrain DUOX2 to produce H(2)O(2). However, alterations of the DUOXA2 NH(2)-terminal domain modify DUOX2 activity triggering superoxide leaking. Our results demonstrate that specific domains of the DUOX maturation factors promote the activation of DUOXs as well as the type of ROS generated by the oxidases.Journal ArticleResearch Support, Non-U.S. Gov'tSCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Characterization of the Duox/DuoxA interplay

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Over-expression of Duox1 in thyroid cell lines using the lentivirus technology

Thyroid cells generate hydrogen peroxide (H2O2) for metabolic purposes. H2O2 is the essential cofactor for iodide oxidation used for thyroid hormone synthesis. In the thyroid, this H2O2 generating system is constituted of Duox1 and Duox2 enzymes which are particular members of the NADPH oxidase family. Duox proteins possess, as NOX5, calcium binding sites regulating their functional activity. It as been demonstrated that physiological H2O2 production in the thyroid is regulated by calcium but also through the cAMP cascade and the IP3-DAG pathway. Using a heterologous system composed of Cos-7 cells expressing Duox1 or Duox2 in combination with their respective maturation factors (DuoxA1 and DuoxA2), we have shown that agents stimulating the cAMP pathway (forskolin or 6-MB-cAMP) positively regulate Duox1 but not Duox2 activity. Duox1 protein is phosphorylated in resting cells and treatment with cAMP analogues increases its phosphorylation status. In vitro phosphorylation experiments demonstrate direct phosphorylation of Duox1 enzyme by purified protein kinase A (PKA). Analysis of Duox1 primary structure reveals three potential phosphorylation sites in Duox1: S955, T1007 and S1217. Substitution of S955 by alanine abolishes Duox1 activity and decreases its degree of phosphorylation. Mutant S1217A diminished also the amount of phosho-Duox1 but leads to hyperactive enzyme which produces 2 times more H2O2 than the wild type. The double Duox1 mutant (S995A/S1217A) produces comparable quantity of H2O2 as wild type and response to calcium and PMA but not to forskolin. These data clearly demonstrate for the first time that Duox1 but not Duox2 activity is positively regulated by the cAMP cascade through direct PKA phosphorylation on the Serine 955. This specific regulation of Duox1 function could allow the thyroid to control precisely the amount of H2O2 produced depending on physiological needs by acting on one of the two Duox isoenzymes expressed in the thyrocyte.Oral communicationinfo:eu-repo/semantics/nonPublishe

Régulations fonctionnelles et transcriptionnelles des NADPH oxydases DUOX

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Dual oxidases and hydrogen peroxide in a complex dialogue between host mucosae and bacteria.

Among the host defense mechanisms against bacteria, leukocyte phagocytosis leads to their hydrogen peroxide (H(2)O(2))-mediated destruction. The recent discovery of dual oxidase (DUOX)-dependent H(2)O(2) generation associated with peroxidase and thiocyanate secretion at the apex of mucosal cells has been similarly interpreted as a killing mechanism. However, the rapid degradation of H(2)O(2) would be expected to reduce the efficiency of this system. It has been demonstrated that H(2)O(2) acts as a chemorepellent for bacteria, and such an effect might be sufficient to block cellular infection. Therefore, H(2)O(2) generation might represent one of the mechanisms that allows the coexistence of mucosae with potentially harmful bacteria. Here, we discuss the possible role of DUOXes and H(2)O(2) in interactions between host mucosae and bacteria to maintain mucosal homeostasis.ReviewResearch Support, Non-U.S. Gov'tinfo:eu-repo/semantics/publishe

Compound heterozygosity for a novel hemizygous missense mutation and a partial deletion affecting the catalytic core of the H(2)O(2)-generating enzyme DUOX2 associated with transient congenital hypothyroidism.

Dual oxidases (DUOX) 1 and 2 are components of the thyroid H(2)O(2)-generating system. H(2)O(2) is used by thyroperoxidase to oxidize iodide for thyroid hormonogenesis. Mutations in the DUOX2 gene have been described in transient and permanent congenital thyroid dyshormonogenesis. We report here a novel genetic defect causing congenital hypothyroidism in a French-Canadian patient. At neonatal screening, the patient had high TSH and low total T(4) levels. (99m)Tc scan showed a normally shaped orthotopic but mildly enlarged thyroid gland, suggesting dyshormonogenesis. Thyroxine treatment was given from 1 month to 17 years, after which it was stopped for re-evaluation and the patient remained euthyroid. The transient congenital hypothyroidism phenotype prompted us to screen for mutations in DUOX2 and DUOXA2 genes using the PCR-amplified direct sequencing method. We found complete inactivation of DUOX2 caused by a partial genomic deletion of one allele inherited from the mother associated with a paternally inherited missense mutation (c.4552G>A, p.Gly1518Ser). The deleted fragment encompasses the entire COOH-terminal end which is responsible for the NADPH-oxidase activity. The Gly1518Ser DUOX2 protein is expressed at the cell surface of transfected cells albeit at low level, but it is non-functional. This study provides further evidence that the permanent or transient nature of congenital hypothyroidism is not directly related to the number of inactivated DUOX2 alleles, suggesting the existence of other pathophysiological factors. (c) 2010 Wiley-Liss, Inc.Journal ArticleFLWINSCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Dual oxidase 1 activity is directly regulated via phosphorylations by the protein kinase A

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Regulation of Duox activities by calcium and phorbol esters

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