3- Dimensional characterization of PanIN (Pancreatic Intraepithelial neoplasia) in cleared human pancreatic cancer tissues by multiplex immunofluorescence

O adenocarcinoma pancreático (PDAC) é uma das neoplasias com maior taxa de mortalidade devido à ausência de métodos de deteção precoce e terapêuticas eficazes, levando à sua deteção numa fase avançada e não-tratável da doença. A sua carcinogénese é explicada através da acumulação de alterações moleculares, numa das três lesões percursoras, neoplasia cística mucinosa, neoplasia intraductal papilar mucinosa e neoplasia intraepitelial pancreatica (PanIN). A PanIN é a lesão percursora mais frequente, caracterizada como uma proliferação epitelial não invasiva, que apresenta vários graus de displasia histológica, refletindo as alterações moleculares existentes nas diferentes fases, afetando os genes K-RAS, P16, TP53, SMAD4, entre outros. A histologia é o gold standard para o estudo de amostras, seus componentes e relação anatómica, através do corte das amostras em fatias finas, fornecendo apenas uma perspetiva bidimensional da amostra, que é limitante e que enviesa a perceção e o estudo da tridimensionalidade dos tecidos, em condições normais e patológicas. De forma a permitir o estudo tridimensional das amostras e evitar os artefactos dados pela reconstituição sequencial de fatias finas têm sido desenvolvidas as técnicas de clearing, que através da redução da opacidade dos tecidos, pela homogeneização dos índices refrativos dos vários constituintes celulares, reduzem a dispersão da luz e permitem a sua penetração. Várias são as técnicas até agora descritas, que se agrupam, consoante o reagente usado, em aquosas ou solventes orgânicos, sendo este último grupo mais eficaz em tecidos fibróticos, como os tecidos cancerígenos. Para a caracterização dos tecidos humanos são necessárias técnicas de imunofluorescência, no entanto a penetração máxima dos anticorpos, até agora descrita para blocos de parafina com PDAC, é de 0.6 mm, devido ao seu elevado conteúdo fibrótico. O presente trabalho teve como objetivo a otimização das técnicas de imunofluorescência aplicadas a tecidos espessos com PDAC, assim como, o estudo da relação anatómica entre os vários graus de PanIN e o PDAC. Para isso foram utilizados cinco blocos de parafina do arquivo do Centro Clínico da Fundação Champalimaud, com 2 mm de espessura, corados através de imunofluorescência com anticorpos anti-citoqueratina 19, anti-AGR2 e anti-p53. A otimização das técnicas de imunofluorescência, aplicadas a amostras espessas, foi feita através da introdução de um passo de recuperação antigénica, digestão enzimática e extensão do tempo de incubação do anticorpo, assim como, um aumento da quantidade de anticorpo por amostra, o que permitiu a visualização das amostras em toda a sua extensão. Todas as marcações citoplasmáticas foram desenvolvidas com êxito, no entanto não foi possível identificar marcação nuclear. Através da análise das amostras branqueadas, coradas com anticorpos anti-citoqueratina 19 e anti-AGR2, foi possível identificar ductos normais, ductos com PanIN e células cancerígenas, no entanto, trabalho adicional é necessário para estabelecer parâmetros de correlação das características apresentadas pelos ductos com PanIN, em amostras branqueadas espessas, com a classificação histológica. A nível anatómico, identifica-se uma tendência para as células cancerígenas se desenvolverem e localizarem junto das ramificações ductais e não perto dos ductos de maior calibrePancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deathliest types of solid cancer mainly due to the lack of early detection techniques and therapeutic options, which makes its diagnosis and detection usually in advanced and untreatable stage of the disease. Currently it is accepted that its carcinogenesis is based on the accumulation of molecular changes in three precursor lesions, namely mucinous cystic neoplasm, intraductal papillary mucinous neoplasm and pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN). PanIN is the most common precursor of PDAC and it is characterized as a non-invasive epithelial proliferation in pancreatic ducts, with different degrees of cytological and morphological atypia that reflects a molecular transformation with mutations on K-RAS, P16, TP53 and SMAD4 genes at different stages. Histology is the gold standard technique for studying tissue specimens, their components and anatomical relationship, which by producing thin sections of tissues, allows a bidimensional analysis that limits and biases the correct tridimensional perspective of normal and pathological situations. To overcome the limitations presented by the analysis of thin sections, clearing techniques have been developed with the goal to reduce tissue’s opacity through the homogenization of refractive indexes within a cell and surroundings, which reduces light scattering and allows its penetration deep in the tissue. Several clearing techniques have been described so far, that can be divided, according to the type of reagent, in solvent-based and aqueous clearing techniques, being the first group more effective with fibrotic tissue, such as tumour samples. Immunofluorescence techniques are necessary to study human samples, but up until now the maximum penetration of an antibody described in the literature in human paraffin-blocks with PDAC is 0.6 mm, due to the high fibrotic content. The present work seeks to optimize deep-antibody immunolabelling of thick samples with PDAC and study the anatomical relationship between different grades-PanIN and PDAC. In order to do that, five archival formalin-fixed paraffin-embedded blocks from Champalimaud Clinical Centre were used and stained with anti-cytokeratin 19, anti-AGR2 and anti-p53 antibodies. The optimization of the immunolabelling was achieved through the application of an antigen retrieval step, enzymatic digestion and an increase of incubation time and amount of antibody, which allowed the visualization of the sample in all its extension. All the cytoplasmic stainings were successful but we were not effective with the nuclear staining. Through the analysis of cleared samples, stained with anti-cytokeratin 19 and anti-AGR2 antibodies, we could identify normal pancreas, PanIN and PDAC. Nevertheless, additional work has to be done to stablish a correlation between the features presented by the ducts of cleared thick samples and the histological grade. Anatomically there’s a tendency for cancer cells to develop and deposit next to ductal terminations and not close to ducts with big caliber

Modelação da Qualidade da Água em Sistemas de Abastecimento Público

A água, enquanto composto dotado de características físico-químicas próprias que afectam e condicionam o seu uso, não se encontra na Natureza no estado puro, i.e. incolor, inodora e insípida. Na verdade, encontra-se associada a outras substâncias que afectam e condicionam os seus possíveis usos. A qualidade de uma água pode, então, ser definida como sendo aquilo que caracteriza a sua adaptabilidade para determinados fins, devendose ter sempre presente que nenhuma água é de boa qualidade para todos os usos. O Programa de Vigilância Sanitária, estabelecido pela Autoridade de Saúde, visa controlar a qualidade da água de abastecimento público. Esta autoridade divide os parâmetros de qualidade da água em três grupos distintos (P1, P2 e P3) para os quais a frequência de amostragem é diferente. Assim, há todo o interesse no desenvolvimento de modelos de previsão os parâmetros químicos incluídos no grupo P2 (manganês e nitrato) e incluídos no grupo P3 (potássio e sódio), para o qual a frequência de amostragem é menor, com base nos parâmetros químicos incluídos no grupo P1 (pH e condutividade). No presente trabalho foram utilizadas Redes Neurais Artificiais (RNAs) para prever a concentração de nitrato, manganês potássio e sódio com base nos valores de pH e de condutividade. Elaboraram-se, testaram-se e avaliaram-se diversas topologias de rede tendo sido utilizado como critério de selecção a minimização quer do desvio absoluto médio quer da média do quadrado dos erros. Foram ainda desenvolvidos modelos de segmentação utilizando os parâmetros químicos incluídos no grupo P1, tendo-se recorrido à estratégia k-means. Os modelos obtidos revelam diferenças entre as propriedades físico-químicas das águas dos diversos concelhos analisados permitindo, após a construção de modelos explicativos da segmentação, caracterizar e separar as amostras provenientes de origem subterrânea das amostras relativas a águas de origem superficial

On the Newton method for set-valued maps

The Newton method is one of the most powerful tools used to solve systems of nonlinear equations. Its set-valued generalization, considered in this work, allows one to solve also nonlinear equations with geometric constraints and systems of inequalities in a unified manner. The emphasis is given to systems of linear inequalities. The study of the wellposedness of the algorithm and of its convergence is fulfilled in the framework of modern variational analysis.The authors are grateful to Oleg Burdakov, Boris Mordukhovich, and Vera Roshchina for their valuable comments. This research was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technologies (FCT), the Portuguese Operational Programme for Competitiveness Factors (COMPETE), the Portuguese National Strategic Reference Framework (QREN), and the European Regional Development Fund (FEDER)

Fighting bacteria using selective drugs for membranes

Tese de mestrado em Bioquímica Médica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015Os antibióticos são fármacos utilizados no tratamento e prevenção de infeções causadas por bactérias ou fungos. Devido à sua elevada eficácia, baixo custo e fácil acesso, as últimas décadas foram marcadas pelo uso excessivo destes fármacos. Como consequência, bactérias e fungos acabaram por desenvolver resistência aos antibióticos convencionais. O desenvolvimento de mecanismos de resistência e a propagação de estirpes resistentes a nível mundial ameaçam a saúde pública de todo o mundo. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (WHO), a estirpe de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) foi, em 2005, a principal causa das 94 000 infeções hospitalares nos Estados Unidos da América, de que resultaram 19 000 mortes. Mais recentemente, em 2013, foram identificados 480 000 novos casos de infeção pela estirpe multi-resistente Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) em 100 países. Assim sendo, existe uma necessidade crescente de desenvolver novos e eficazes agentes antimicrobianos, sobretudo com mecanismos de ação diferentes dos usados pelos antibióticos convencionais. Só desta forma será possível garantir que, num futuro próximo, existirão alternativas eficazes para curar infeções graves e evitar, por exemplo, que intervenções médico-cirúrgicas, mesmo as mais simples, se tornem procedimentos de alto risco. De acordo com o seu mecanismo de ação, os antibióticos podem ser classificados como bacteriostáticos, quando inibem o crescimento bacteriano, ou bactericidas, quando causam a morte das bactérias. Os péptidos antimicrobianos (AMPs) têm ganho bastante visibilidade nas últimas décadas. Este grupo de péptidos está presentes em grande parte dos organismos vivos, desde bactérias, fungos, plantas e diversos animais. Além disso, são elementos fundamentais da imunidade inata da maioria dos organismos multicelulares. Ao contrário dos antibióticos convencionais, os péptidos antimicrobianos têm um largo espetro de ação contra bactérias, fungos e vírus, atuando através de mecanismos frequentemente relacionados com a disrupção de membranas, ao contrário dos antibióticos convencionais cujos alvos principais são processos metabólicos intracelulares. Vários estudos indicam que o desenvolvimento de resistência bacteriana contra AMPs é muito difícil porque as lesões nas membranas lipídicas são dificilmente reparáveis. Desta forma, os péptidos antimicrobianos têm sido propostos como solução para contornar a problemática associada à crescente resistência bacteriana. Em termos gerais, os péptidos antimicrobianos são caracterizados por serem pequenos (11 a 50 resíduos de aminoácidos), possuírem carga global positiva devido à presença de aminoácidos carregados positivamente, tais como lisinas e argininas, e por adquirirem uma estrutura anfipática que os torna solúveis em ambientes aquosos sem impedir a sua interação com membranas. Os péptidos translocadores de membranas (CPPs) são, tal como os AMPs, um grupo de péptidos bioativos em membranas. Estas moléculas são capazes de translocar membranas biológicas sem as destruir, e por isso têm sido utilizados como vetores de transporte de outras moléculas para o interior das células. Os CPPs partilham várias características estruturais com os AMPs, como a presença de cargas positivas em excesso e o facto de ambos serem moléculas anfipáticas, o que tem impulsionado o estudo de CPPs como possíveis AMPs, e vice-versa. O principal objetivo deste trabalho foi validar experimentalmente a hipótese de que as proteínas estruturais de vírus são uma fonte rica em sequências de potenciais péptidos antibacterianos. A atividade antibacteriana de dezasseis AMPs e sete CPPs obtidos a partir de proteínas estruturais de diferentes vírus, foi determinada em quatro estirpes bacterianas, duas Gram-positivas, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 33591 (MRSA), e duas Gram-negativas, Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. As estirpes Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922 foram selecionadas para este estudo pois são frequentemente utilizadas como estirpes de referência para Gram-positiva e Gram-negativa, respetivamente. A estirpe Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 33591 foi selecionada pois, além de representar uma estirpe cujas infeções têm taxas de mortalidade muito elevadas, permite introduzir uma bactéria resistente no estudo. A estirpe Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 foi testada uma vez que representa a principal bactéria Gram-negativa causadora de infeções em ambientes hospitalares. Através da determinação da concentração mínima inibitória (MIC), três péptidos revelaram elevada atividade antibacteriana contra todas as estirpes testadas: o vAMP 059, com valores de MIC entre 0.78 μM e 6.25 μM; o vCPP 0769, com valores de MIC entre 3.13 μM e 25 μM; e o vCPP 2319, com valores de MIC entre 1.56 μM e 3.13 μM. Para os três péptidos mais ativos foi determinada a concentração mínima bactericida (MBC). O péptido vCPP 2319 revelou ser bactericida contra todas as estirpes testadas, com um valor de MBC de 3.13 μM. O péptido vAMP 059 mostrou ter uma ação bacteriostática contra Escherichia coli ATCC 25922, com um valor de MBC igual a 25 μM, mas bactericida para as restantes bactérias testadas, com valores de MBC entre 1.56 μM e 6.25 μM. Por fim, o péptido vCPP 0769 revelou ser bactericida contra as duas estirpes Gram-negativas testadas, com valores de MBC entre 50 μM e 6.25 μM, mas bacteriostático contra as duas estirpes Gram-positivas, com um valor de MBC superior a 100 μM. Para os péptidos vAMP 059 e vCPP 2319, com ação bactericida contra Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, determinou-se a cinética de morte. Para tal, foram realizados dois métodos distintos: 1) Um método convencional baseado na contagem de colónias bacterianas obtidas após diferentes tempos de atuação de cada péptido. Para este ensaio, testou-se as bactérias Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC; 2) Um método inovador que permite seguir a cinética de morte bacteriana em tempo real por citometria de fluxo através da marcação de bactérias com o kit de viabilidade celular “live/dead”. Uma vez que as sondas que constituem o kit “live/dead” permitem distinguir rapidamente bactérias vivas, com a membrana intacta, de bactérias mortas, com a membrana permeabilizada, este método também permite determinar se os péptidos têm capacidade de permeabilizar a membrana bacteriana. Para este ensaio testou-se o efeito dos péptidos na bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus ATCC 25923. De acordo com os resultados obtidos pelo método convencional, o péptido vAMP 059 revelou atuar por um mecanismo de morte rápido para Staphylococcus aureus ATCC 25923, conseguindo matar 99.9% das bactérias em 5 minutos, e para Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, conseguindo matar 99.4% das bactérias em 2 horas. O ensaio da citometria de fluxo confirmou uma cinética de morte rápida contra Staphylococcus aureus ATCC 25923, e além disso, provou que o péptido vAMP 059 causa permeabilização da membrana celular desta estirpe. Relativamente ao péptido vCPP 2319, e de acordo com o método baseado na contagem de colónias, a sua cinética de morte também revelou ser rápida para as duas estirpes testadas, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, conseguindo matar 98.8% e 99.5% da população bacteriana, respetivamente, ao fim de 4 horas de atuação. O ensaio de citometria confirmou uma cinética de morte rápida para Staphylococcus aureus ATCC 25923, e estabeleceu que o péptido vCPP 2319 atua por um mecanismo de morte baseado na permeabilização da membrana desta estirpe. Os dados obtidos permitem concluir que os vírus são fontes de péptidos antibacterianos, sendo que se encontrou um AMP com elevada atividade antibacteriana. Também se confirmou que a dicotomia entre CPPs e AMPs é ténue; de uma biblioteca de sete CPPs, dois CPPs revelaram elevada atividade antibacteriana. Os três AMPs encontrados têm atividade elevada e um espetro de ação alargado, embora com modos de atuação diferentes

New insights on the interplay between psychopharmacology and neuroplasticity in psychiatric disorders

Tese de Doutoramento em Ciências da SaúdeIt is now clear that various forms of structural plasticity, including the generation of new neurons and glial cells, may modify pathophysiological processes in neuropsychiatric disorders, namely in depression. In fact, several studies have shown decreased hippocampal neurogenesis in depressed patients, while treatment with different antidepressant drugs in animal models increases neurogenesis in this region, allowing the recovery from emotional and cognitive changes. However, these effects have not been described for all the available classes of antidepressant drugs. Furthermore, the neuroplastic effects of antidepressants in other neurogenic regions such as the hypothalamus have yet to be determined. Despite the importance of these drugs in the recovery from depression, a significant proportion of depressed patients reveal incomplete remission and develop treatment-resistant forms of the disorder. The use of atypical antipsychotics in these cases has been widely used in the clinical setting. However, the neuroplastic effects of these drugs in depression and schizophrenia are still largely unknown. Taking this into consideration we aimed to explore new perspectives on the interplay between psychopharmacology and neuroplasticity in these psychiatric disorders. To explore the neuroplastic effects of the antidepressant Pirlindole, a MAO-A (monoamine oxidase, type A) inhibitor, we used the unpredictable chronic mild stress (uCMS) animal model of depression. Our results indicate that Pirlindole is able to reverse the behavioural effects of stress exposure, potentiating hippocampal adult neurogenesis and rescuing the stress-induced dendritic atrophy of granule neurons in the dentate gyrus of the hippocampus. These results further reinforce the notion that the modulation of monoaminergic neurotransmission is involved in the neuroplastic effects of currently available antidepressant drugs. To dissect the potential actions of antidepressants in adult neurogenesis in the hypothalamus we treated animals exposed to uCMS with two different classes of antidepressants: fluoxetine (a selective serotonin reuptake inhibitor) and imipramine (a tricyclic antidepressant). Our results demonstrate that chronic stress and antidepressant treatment can modulate hypothalamic neurogenesis. Moreover, we proved that different classes of antidepressants, with an opposite action on appetite and body weight gain, differentially modulate hypothalamic neurogenesis. This data indicates that in addition to the neuroplastic effects on the hippocampus, stress and antidepressant drugs also modulate hypothalamic adult neurogenesis.Furthermore, we explored the role of neuroplasticity in the therapeutic actions of atypical antipsychotics in depression. To achieve this, we treated animals exposed to uCMS with a classical (haloperidol) and an atypical (clozapine) antipsychotic. Our data demonstrates that the atypical antipsychotic clozapine improved measures of depressive-like behavior while haloperidol had no beneficial effect, aggravating learned helplessness in the forced swimming test and behavior flexibility in a cognitive task. Importantly, an upregulation of adult neurogenesis and neuronal survival was observed in animals treated with clozapine while haloperidol promoted a downregulation of these processes. These results demonstrate that the atypical antipsychotic is able to reverse the behavioral effects of chronic stress by improving adult neurogenesis, cell survival and neuronal reorganization. Finally, to understand the impact of different classes of antipsychotics in the negative and cognitive symptoms of schizophrenia, we used a neurodevelopmental model of schizophrenia. Animals expose prenatally to the cytostatic agent methylazoxymethanol (MAM) presented specific cognitive deficits and social impairments. The classical antipsychotic haloperidol presented no beneficial effects in these behavioral dimensions. The atypical antipsychotic clozapine and risperidone revealed a positive effect on both dimensions while aripiprazole presented a significant effect in the social measure. Adult gliogenesis is affected in animals exposed to MAM, being modulated by the atypical antipsychotics used. Neurogenesis is not altered in MAM animals, with haloperidol negatively affecting this phenomenon. In this work, we proved that classical and atypical antipsychotics differentially modulate hippocampal cell genesis possibly contributing to different behavioural actions in hippocampal dependent functions. Together, these findings contribute to expand our knowledge on the role of psychopharmacological agents (including antidepressants and antipsychotics) on the modulation of different neuroplastic events, including cell genesis and neuronal remodelling. In the future, this knowledge may help to pave the way for new therapeutic interventions both in depression and schizophrenia.É actualmente sabido que várias formas de plasticidade estrutural, incluindo a formação de novos neurónios e células da glia, podem modificar o processo patofisiológico em algumas doenças neuropsiquiátricas, nomeadamente a depressão. De facto, vários estudos têm demonstrado uma redução da neurogénese hipocampal em pacientes com depressão. Para além disso, o tratamento com diferentes fármacos, nomeadamente os antidepressivos, revelou em modelos animais, aumentar a neurogénese nesta região cerebral, permitindo uma recuperação na componente emocional e cognitiva. Contudo, estes efeitos não estão descritos para todas as classes de antidepressivos disponíveis. Além disso, os efeitos dos antidepressivos na neuroplasticidade em outras regiões neurogénicas como o hipotálamo ainda não foram determinados. Apesar da importância destes fármacos na recuperação da depressão, uma proporção significativa de pacientes revela remissão incompleta bem como formas resistentes ao tratamento da doença. Nestes casos, o uso de antipsicóticos atípicos tem sido amplamente utilizado no contexto clínico. No entanto, os efeitos destes fármacos na neuroplasticidade na depressão e esquizofrenia são ainda amplamente desconhecidos. Tendo isto em consideração, propusemos explorar novas perspectivas na inter-relação entre a psicofarmacologia e a neuroplasticidade nestas doenças psiquiátricas. Para determinar os efeitos do antidepressivo inibidor da MAO-A (monoamina oxidase, tipo A) Pirlindol na neuroplasticidade, utilizamos o modelo animal de exposição a stress crónico moderado e imprevisível (uCMS). Os nossos resultados indicam que o Pirlindol é capaz de reverter os efeitos comportamentais de exposição ao stress, potenciando o aumento na neurogénese no hipocampo adulto e recuperando igualmente a atrofia dendrítica induzida pelo stress em neurónios granulares no giro dentado do hipocampo. Estes resultados reforçam a ideia de que a modulação da neurotransmissão monoaminérgica está envolvida nos efeitos neuroplasticos promovida pelos antidepressivos. Para dissecar, as acções dos antidepressivos na neurogénese hipotalâmica, utilizamos o modelo animal de depressão uCMS e tratamento com diferentes classes de antidepressivos: fluoxetina (um inibidor selectivo da reabsorção de serotonina) e imipramina (um antidepressivo tricíclico). Os nossos resultados demonstram que o stress crónico e o tratamento com antidepressivos modulam a neurogénese no hipotálamo. Além disso, provou-se que diferentes classes de antidepressivos, com uma acção contrária no apetite e no ganho de peso corporal, modulam a neurogénese no hipotálamo de uma forma diferencial. Estes resultados, indicam que, para além do hipocampo, o stress e os antidepressivos também modulam a neurogénese no hipotálamo adulto. Em seguida, exploramos o papel da neuroplasticidade nas acções terapêuticas dos antipsicóticos atípicos na depressão. Para isso, utilizou-se o modelo animal de depressão uCMS e tratamento com o antipsicótico clássico (haloperidol) e o atípico (clozapina). Os nossos dados demonstram que, o antipsicótico atípico clozapina melhorou o comportamento depressivo. Por outro lado, o haloperidol não teve qualquer efeito benéfico, agravando o desalento aprendido no teste de natação forçada e a flexibilidade comportamental numa tarefa cognitiva. Simultaneamente observou-se um aumento da neurogénese adulta e da sobrevivência neuronal em animais tratados com clozapina, enquanto que o haloperidol promoveu uma redução nestes processos. Estes resultados, demonstram que o antipsicótico atípico é capaz de reverter os efeitos comportamentais do stress crónico através da melhoria na neurogénese adulta, da sobrevivência celular e da reorganização neuronal. Por último, para compreender o impacto das diferentes classes de antipsicóticos nos sintomas negativos e cognitivos da esquizofrenia, utilizamos um modelo de neurodesenvolvimento desta mesma patologia. Os animais expostos no período pré-natal ao agente acetato de metilazoximetanol (MAM) apresentaram défices cognitivos e sociais. O antipsicótico clássico haloperidol não apresentou efeitos benéficos nestas dimensões de comportamento. Por outro lado, os antipsicóticos atípicos, clozapina e risperidona, apresentaram um efeito positivo em ambas as dimensões com o aripiprazol apresentando apenas um efeito estatístico na dimensão social. A gliogénese adulta esta afectada nos animais MAM, sendo esta modulada pelos antipsicóticos atípicos usados. A neurogénese não se encontra alterada neste modelo, sendo, no entanto, negativamente afectada pelo haloperidol. Neste trabalho, provamos que os antipsicóticos clássicos e atípicos modulam diferencialmente a formação de novas células no hipocampo, contribuindo possivelmente para diferentes acções comportamentais, em funções dependentes do hipocampo. Em suma, estes resultados contribuem para expandir o nosso conhecimento sobre o papel de agentes psicofarmacológicos (incluindo antidepressivos e antipsicóticos) na modulação de diferentes eventos neuroplásticos, incluindo a formação de novas células e a remodelação neuronal. No futuro, este conhecimento poderá ajudar na implementação de novas intervenções terapêuticas tanto na depressão como na esquizofrenia.The work presented in this thesis was performed in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), University of Minho. Financial support was provided by a PhD grant (SFRH/BD/88825/2012) from the FCT - Foundation for Science and Technology -, by FEDER funds through the Operational Programme Competitiveness Factors - COMPETE and National Funds through FCT under the project POCI-01-0145-FEDER-007038; and by the project NORTE-01-0145-FEDER-000013, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF)

Oxetane &-amido acids : synthesis and derivatisation

Tese de doutoramento em Química (Química Orgânica), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2009In the present work the potential of oxetane δ-amino acids as scaffolds was evaluated. While there is an ample precedence for the use of 6- and 5-membered carbohydrate-derived amino acids as scaffolds, there are no reports on oxetanebased libraries. The oxetane ring is an interesting source of rigidity and well-defined exit vectors, and this unit is present in some important naturally occurring bioactive molecules, such as taxol, oxetanocin or oxetin. Nevertheless, the intrinsic chemical and pharmacological properties or inherent advantages of the oxetanes are far from clear. Oxetane δ-amino acids with the general structure i were synthesised using carbohydrates as starting materials in order to obtain different and well-defined stereochemistry. On a scaffold synthesis level, the oxetane moiety was decorated with different R groups such as hydroxyl, methoxyl or fluorine, and the resulting final scaffolds i exhibited D-lyxo, D-ribo, D-arabino and D-xylo configurations. Scaffold derivatisation was performed introducing valuable pharmacophores such as 1,2,4-oxadiazoles or 1,2,3-triazoles to generate small libraries of compounds with general structures ii and iii, respectively. 1,2,4-Oxadiazoles were obtained by reaction of oxetane δ-amino acids i, with different hydroxyamidines via a basic activation followed by cyclodehydration. The scaffold was further derivatised so that the resulting compounds ii exhibited tert-butoxycarboxyl, hydrogen, acetyl or mesyl as group R1. 1,2,3-Triazoles were obtained by the so called click reaction of an oxetane δ-azido ester with different acetylenes catalysed by Cu(I). Oxetanes proved to be stable under the chosen derivatisation conditions with exception of the 3- hydroxy derivatives which decomposed under basic conditions. Moreover, corresponding 1,2,4-oxadiazole libraries were synthesised on two diastreomeric bicyclic δ-amino acids leading to a new family of compounds with general structure iv. The synthesised compounds were characterised by techniques such as NMR, MS, HRMS, optical rotation, elemental analysis and, for crystalline compounds, by X-Ray crystallography. Physicochemical and metabolic properties of the synthesised molecules were evaluated. Prediction of properties such as octanol/water partition coefficient, polar surface area, effective intestinal permeability, pKa, blood-brain barrier penetration and Andrew binding score was possible by the use of in silico tools. Moreover, some of the compounds experimental data on octanol/water partition coefficients, thermodynamic solubility, permeability and susceptibility towards metabolic degradation in human and mouse microsomes were obtained. All target compounds exhibited the physicochemical and metabolic properties desired in medicinal chemistry.Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/16592/2004

Mercury methylation versus demethylation: main processes involved

It is well known that mercury presents high toxicity, causing a great damage to the environment and living organisms; however, its properties depend on the mercury species present. Organomercury compounds, where methylmercury is included, cause more concern. Since 60-70’s, several methylation mechanisms are known. Generally, methylmercury can be formed naturally in the aquatic environment by two general pathways: chemical methylation (abiotic) and microbial (biotic) processes. At the same time, methylmercury can be also decomposed abiotically or by the action of several demethylating microbes, or demethylators, ranging from anaerobes to aerobes. Regarding the biotic methylmercury demethylation, two distinct vias - oxidative and reductive - might be used by those microorganisms, differing in the final products obtained. In relation to the reductive processes, two pathways might occur. The first one involves the mercury resistance operon (mer) whereas the second one involves sulphide ions; however, the former is considered to be the most common pathway. Regarding the mer operon, some bacteria only carry on a narrow-spectrum operon (merA), being only able to reduce inorganic mercury (Hg(II)) to elemental mercury (Hg0). On the other hand, others beyond this operon also carry on a broad-spectrum operon (merB). These microorganisms are able to decompose methylmercury to Hg0. Taking into account all of these processes, in the present work the most referred methylation and demethylation mechanisms found in aquatic environments are discussed, as well as the environmental factors that influence them. Factors related with the inorganic mercury/methylmercury availability and those that affect directly the activity of methylators and demethylators are also referred. Generally, the relationships encountered are complex and sometimes significant shifts on the microbial communities may be observed. These changes can alter the processes involving the mercury species, as well as the final products obtained. In conclusion, the abiotic factors and the type of microorganisms that are present in the environment, including their genetic patrimony, influence significantly the presence and the type of the mercury species. Furthermore, there are environmental factors, such as redox conditions, sulphides and organic matter that also affect the mercury dynamic and the equilibrium existents

Linear differential games and high precision attitude stabilization of spacecrafts with large flexible elements

FCT, QREN, FEDER, COMPET

UPLC MS/MS Method for the Analysis of Cardiovascular Medications in Putrefied Specimens obtained from an Exhumation Autopsy

Poster apresentado no Symposium Alternative Sampling Strategies in Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring, Set 18-19 de 2014, Ghent (Bélgica)N/