Engineering of cytochrome P450 monooxygenases for application in phenol synthesis

Die biokatalytische Produktion von Fein- und Bulk-Chemikalien ist von wachsender Bedeutung für die Entwicklung nachhaltiger Synthesewege. P450 Monooxygenasen spielen eine Schlüsselrolle in der selektiven Funktionalisierung von nicht-aktivierten C-Atomen mit Luftsauerstoff, eine der Hauptherausforderungen in der organischen Synthese. Insbesondere die industrielle Synthese von Phenol, unter Verwendung von Benzol als Startmaterial, ist ineffizient und nur durch den hohen Bedarf des Nebenproduktes Aceton profitabel. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Entwicklung von Varianten der bakteriellen P450 Monooxygenase BM3 aus Bacillus megaterium zur Anwendung in der Synthese von Phenolen. Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Entwicklung einer effizienten P450 Monooxygenase für die Produktion industriell bedeutender o-Phenole, die als Bausteine für die Synthese von Pharmazeutika, Plastik oder Vitaminen verwendet werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden P450 BM3 Varianten identifiziert, welche eine verbesserte Aktivität für Benzolsubstrate aufweisen, sowie eine effizientere Nutzung des NADPH Co-Faktors und ein breiteres Substratspektrum. Dreißig potentielle Substrate wurden mit der Variante M2 (R47S, Y51W, I401M) untersucht und die Umsetzung von 12 Benzolen im Detail charakterisiert. Insbesondere die Hydroxylierung von Anisol mit Variante M3 (R47S, Y51W, A330F, I401M) war besonders effizient (>95% Selektivität o-Position), wobei eine finale Produktkonzentration von mehr als einem 1 g/L erreicht wurde. Neben dem breiterem Substratspektrum und der Entwicklung eines Protokolls für die semi-präparative Synthese der entsprechenden Phenole, wurde der Einfluss von weitläufig verwendeten Lösungsvermittlern wie DMSO auf die aromatische Hydroxylierung von Toluol untersucht. Die effizienteste Produktion von o-Kresol war möglich ohne den Einsatz von zusätzlichen Lösungsvermittlern, was eine kostengünstigere Synthese und vereinfachte Produktaufreinigung erlaubt. Die katalytische Charakterisierung der entsprechenden P450 BM3 Varianten wurde durch Substrat-Docking Studien zur Aufklärung der Selektivitäten ergänzt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die aromatische Hydroxylierung von Benzolen durch Wechselwirkungen mit Phenylalanine 87 im aktiven Zentrum von P450 BM3 dirigiert wird. Der Austausch von F87 gegen alle 19 kanonischen Aminosäuren führt zu einem Verlust der Fähigkeit von P450 BM3 zur effizienten aromatischen Hydroxylierung von p-Xylol. Daraus lässt sich erschließen, dass die Aminosäure F87 essentiell für die aromatische Hydroxylierung von Benzolen durch P450 BM3 ist. Die systematische Untersuchung ausgewählter Substrate unterstützt die Hypothese, dass sowohl Regioselektivität als auch Aktivität insbesondere durch pi-pi-Wechselwirkungen zwischen Protein und Benzol-Substraten gesteuert wird. Der Austausch von Alanin gegen Phenylalanin an Position 330, nahe am aktiven Zentrum von P450 BM3, erlaubt eine stärkere Bindung und bis zu 49-fach erhöhte Aktivität für Mesitylen. Katalytische Daten und Docking Ergebnisse weisen in beiden Untersuchungen auf eine T-förmige Bindung der Benzole im aktiven Zentrum von P450 BM3 hin. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung von zwei neuartigen Methoden für die Gelenkte Evolution von Biokatalysatoren beschrieben, OmniChange und PTRec. OmniChange ermöglicht zum ersten Mal die effiziente und zuverlässige Saturierung von bis zu fünf unabhängigen Aminosäuren innerhalb einer DNA Sequenz, wobei die aktuellen Anforderungen in der fokussierten Mutagenese erfüllt werden. Die detaillierte Analyse von 48 sequenzierten Klonen hat gezeigt, dass bis zu 84% aller möglichen Codons an den ausgewählten Positionen eingebaut wurden. Ein einfaches und robustes Protokoll erlaubt insbesondere die Untersuchung kooperativer Effekte in Proteinstrukturen. Basierend auf dem OmniChange Protokoll wurde die PTRec Methode zur Rekombination von Proteinen mit weniger als 50% Sequenzidentität entwickelt. Beispielhaft wurde eine Modellbibliothek bestehend aus drei Phytase-Sequenzen generiert. Die Chimären wurden sequenziert und die Verteilung der spezifischen Domänen untersucht. Hierbei konnte eine nahezu statistisch ideale Verteilung der spezifischen Domänen festgestellt werden. OmniChange und PTRec basieren auf der Verwendung phosphoro-thiolierter Nukleotide, welche eine robuste und nahezu sequenzunabhängige Assemblierung von bis zu fünf DNA Fragmenten ermöglichen. In beiden Fällen war E. coli in der Lage die assemblierten, nicht-ligierten Plasmide aufzunehmen und als funktionelle Plasmide zu replizieren, wobei die 10 DNA-nicks kein Problem darstellten. Anhand der beiden entwickelten Methoden können einzigartige Biokatalysatoren für spezifische Anwendungen wie z.B. für biokatalytische Prozesse maßgeschneidert werden

Phosphorothioate-based DNA recombination: an enzyme-free method for the combinatorial assembly of multiple DNA fragments

Rational guided generation of protein chimeras has developed into an attractive approach in protein engineering for tailoring catalytic and biophysical properties of enzymes. Combinatorial recombination of structural elements or whole protein domains is still technically challenging due to sequence dependent biases diminishing the overall quality of resulting chimeric libraries. Since methods for generating such libraries are often limited by a low frequency of crossover points and suffer from challenges in handling, we developed the phosphorothioate-based DNA recombination method (PTRec). PTRec is an enzyme-free method and only requires a short stretch of four amino acids that is identical among the proteins to be recombined in order to define a single crossover point. In a PTRec-generated chimeric library that shuffled five domains of phytase using genes from three different species, 88% of 42 randomly picked and sequenced genes were efficiently recombined. Furthermore, PTRec is a technically simple, fast, and reliable method that can be used for domain-and exon-shuffling or recombination of DNA fragments in general. </jats:p

Reconstructive procedures for impaired upper airway function: laryngeal respiration

The larynx is the "bottleneck" of the human airway. For this reason, the effects of stenosing laryngeal pathologies on the vital factor respiratory gas exchange are particularly critical.Internal stabilization is a prerequisite for recovery of the laryngeal respiratory function in severe forms of inspiratory collapse (laryngomalacia). Effective laser surgery techniques have been developed to this end in recent years.Glottis-dilating surgery in cases of bilateral vocal cord motion impairment is now moving in the direction of endoscopic laser cordotomy or cordectomy, whereas arytenoidectomy and open surgical procedures are now used only rarely due to higher secondary morbidity rates. In individual cases, in particular if functional recovery is expected, temporary laterofixation of a vocal cord using an endoscopic suturing technique can be a helpful approach.Extensive laryngeal defects can be covered by means of composite grafts with mucosal lining, a supporting skeleton and their own vascularization. Autologous transplantation of the larynx, with its complex surgical and immunological problems, has become a manageable procedure. The problems of post-transplantation reinnervation and risk assessment of immunosuppression-induced recurrence of the tumor are still under consideration.Reanimation of the bilaterally paralyzed larynx by means of neurorrhaphy (neurosuture), neural grafting and, more recently, functional electrostimulation (pacemaker) represents a challenge for the coming years. In most cases of paralysis of the recurrent laryngeal nerve, a part of the muscles is maintained by synkinetic reinnervation when therapy is carried out, which however also prevents effective vocal cord movement due to simultaneous activity of agonists and antagonists. Modulation of reinnervation by means of electrostimulation and modern genetic therapy approaches justify hopes of better outcomes in the future.Der Kehlkopf stellt hinsichtlich des Atemwegsquerschnittes den Flaschenhals des menschlichen Atemweges dar. Aus diesem Grund wirken sich stenosierende Kehlkopferkrankungen in besonderem Maße auf den lebenswichtigen Atemgasaustausch aus.Die Wiederherstellung der Atemfunktion des Larynx erfordert bei schweren Formen des inspiratorischen Kollapses (Laryngomalazie) die innere Stabilisierung. In den letzten Jahren sind hierzu wirksame Verfahren der laserchirurgischen Intervention entwickelt worden.Die Glottis erweiternde Chirurgie bei bilateraler Immobilität der Stimmlippen zeigt einen Trend zur endoskopischen laserchirurgischen Chordotomie bzw. Chordektomie, während die Arytänoidektomie und offen chirurgische Verfahren wegen stärkerer Sekundärmorbidität nur noch selten zum Einsatz kommen. Im Einzelfall, insbesondere bei absehbarer Funktionswiederkehr, kann die temporäre Laterofixation einer Stimmlippe durch eine endoskopische Nahttechnik hilfreich sein.Ausgedehnte Kehlkopfdefekte können mit Composite grafts, die über eine Schleimhautauskleidung, ein Stützskelett und eine eigene Gefäßversorgung verfügen, gedeckt werden. Die autologe Transplantation des Kehlkopfes ist mit ihren komplexen chirurgischen und immunologischen Problemen beherrschbar geworden. Probleme der Reinnervation nach Transplantation und der Abwägung des Risikos eines durch die Immunsuppression induzierten Tumorrezidivs sind noch Gegenstand weiterer Untersuchungen.Die Reanimation des bilateral gelähmten Kehlkopfes durch Nervennaht, durch Nerventransfer und neuerdings durch funktionelle Elektrostimulation (Pacemaker) stellt die Herausforderung für die nächsten Jahre dar. Bei der überwiegenden Zahl der Rekurrensparesen liegt zum Zeitpunkt der Therapie eine synkinetische Reinnervation vor, die einen Teil der Muskulatur erhält, aber durch gleichzeitige Aktivität von Agonisten und Antagonisten eine effektive Stimmlippenbewegung verhindert. Die Modulation der Reinnervation durch Elektrostimulation und moderne Ansätze der Gentherapie lassen ein zukünftig besseres Outcome erwarten

OmniChange: The Sequence Independent Method for Simultaneous Site-Saturation of Five Codons

Focused mutant library generation methods have been developed to improve mainly "localizable" enzyme properties such as activity and selectivity. Current multi-site saturation methods are restricted by the gene sequence, require subsequent PCR steps and/or additional enzymatic modifications. Here we report, a multiple site saturation mutagenesis method, OmniChange, which simultaneously and efficiently saturates five independent codons. As proof of principle, five chemically cleaved DNA fragments, each carrying one NNK-degenerated codon, were generated and assembled to full gene length in a one-pot-reaction without additional PCR-amplification or use of restriction enzymes or ligases. Sequencing revealed the presence of up to 27 different codons at individual positions, corresponding to 84.4% of the theoretical diversity offered by NNK-degeneration. OmniChange is absolutely sequence independent, does not require a minimal distance between mutated codons and can be accomplished within a day

A tailor‐made, self‐sufficient and recyclable monooxygenase catalyst based on coimmobilized cytochrome P450 BM3 and glucose dehydrogenase

Cytochrome P450 monooxygenases (P450s) promote hydroxylations in a broad variety of substrates. Their prowess in C–H bond functionalization renders P450s promising catalysts for organic synthesis. However, operating P450 reactions involve complex management of the main substrates, O2 and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) reducing equivalents against an overall background of low operational stability. Whole‐cell biocatalysis, although often used, offers no general solution to these problems. Herein, we present the design of a tailor‐made, self‐sufficient, operationally stabilized and recyclable P450 catalyst on porous solid support. Using enzymes as fusion proteins with the polycationic binding module Zbasic2, the P450s BM3 (from Bacillus megaterium) was coimmobilized with glucose dehydrogenase (type IV; from B. megaterium) on anionic sulfopropyl‐activated carrier (ReliSorb SP). Immobilization via Zbasic2 enabled each enzyme to be loaded in controllable amount, thus maximizing the relative portion of the rate limiting P450 BM3 (up to 19.5 U/gcarrier) in total enzyme immobilized. Using lauric acid as a representative P450 substrate that is poorly accessible to whole‐cell catalysts, we demonstrate complete hydroxylation at low catalyst loading (≤0.1 mol%) and efficient electron coupling (74%), inside of the catalyst particle, to the regeneration of NADPH from glucose (27 cycles) was achieved. The immobilized P450 BM3 showed a total turnover number of ∼18,000, thus allowing active catalyst to be recycled up to 20 times. This study therefore supports the idea of practical heterogeneous catalysis by P450s systems immobilized on solid supportEuropean CommissionDepto. de Ingeniería Química y de MaterialesFac. de Ciencias QuímicasTRUEpu