Construção e validação de mutantes de Escherichia coli para aumentar a produção de curcumina por uma estirpe geneticamente modificada

Dissertação de mestrado em BioengenhariaCurcumin has been reported for its beneficial therapeutic properties including as anti-cancer agent. However, it has poor bioavailability and it is quickly metabolized in the human body, implying a repetitive oral administration if a therapeutic effect is envisaged. Besides, its extraction from plants is very expensive. For these reasons, the use of microorganisms to produce it on large scale and with greater yields constitutes an interesting alternative. With this aim, Escherichia coli K-12 MG1655 (DE3) was previously engineered with three enzymatic steps (4-coumarate-CoA ligase, diketide-CoA synthase and curcumin synthase 1) that catalyze the production of curcumin from ferulic acid. In the present study, the optimal strain, operational conditions and media composition for the production of curcumin by E. coli harboring the artificial biosynthetic pathway were established. Previously, a standard two-step fermentation strategy (LB+M9 minimal medium) was used. Although feasible at the laboratory scale, the biomass separation is much more difficult, laborious and expensive in large-scale fermentations. Therefore, herein a single medium formulation more suitable for the production of curcumin at an industrial set-up was implemented. MOPS minimal medium, TB and LB were evaluated. Using the optimized conditions, the curcumin concentration obtained in this study was the highest reported to be produced by a heterologous organism, 686.7±59.7 µM in TB (43 h) and 822.6±28.1 µM in LB+M9 (63 h). These results were obtained using E. coli BL21 (DE3) that was identified as the best producer since it produced 3.7 times more curcumin than E. coli K-12 MG1655 (DE3). Moreover, curcumin toxicity against E. coli cells was evaluated. The tests performed showed that curcumin concentrations above 400 µM influence negatively the E. coli cells growth. Furthermore, one of the purposes of the current work was to construct and validate several E. coli mutants (e.g. ΔfumA,fumB,fumC) previously identified by an in silico approach as the most promising towards an increased production of curcumin from ferulic acid. The deletion of fumB gene from E. coli K-12 MG1655 (DE3) genome was accomplished and it resulted in a faster curcumin production in the initial 21 h, but after 63 h, the curcumin production by this mutant was 2.6 times lower as compared to the ‘original’ strain (i.e. the strain harboring the curcuminoids biosynthetic pathway but with no gene knockout). The same deletion in E. coli BL21 (DE3) genome resulted in a more significant decrease in curcumin production. In the future, the triple knock-out (ΔfumA,fumB,fumC) should be constructed to evaluate if curcumin production can indeed be improved as predicted in silico.A curcumina tem sido reportada pelas suas propriedades benéficas incluindo como agente anticancerígeno. Apesar da curcumina apresentar um alto potencial terapêutico, tem uma baixa biodisponibilidade e é rapidamente metabolizada no organismo humano, o que implica uma repetitiva administração oral para atingir o efeito terapêutico pretendido. Além disso, a sua extração a partir das plantas é muito dispendiosa. Por estas razões, o uso de microrganismos para a produzir em larga escala e com melhores rendimentos constitui uma alternativa atraente. Neste sentido, Escherichia coli K-12 MG1655 (DE3) foi previamente geneticamente modificada adicionando três reações enzimáticas (4-cumarato-CoA ligase, dicetídeo-CoA sintase e curcumina sintase 1) que catalisam a produção de curcumina a partir do ácido ferúlico. No presente trabalho foi estabelecida a estirpe, as condições operacionais e a composição de meio ótimas para a produção de curcumina por E. coli contendo a via biossintética artificial. Anteriormente, utilizou-se uma estratégia comum de dois passos (LB+meio mínimo M9). Apesar de ser praticável numa escala laboratorial, a separação de biomassa é muito mais difícil, trabalhosa e dispendiosa numa fermentação em grande escala. Assim, foi implementada uma única formulação de meio mais adequada para a produção de curcumina a nível industrial. O meio mínimo MOPS, TB e LB foram avaliados. Usando as condições otimizadas, a concentração de curcumina produzida neste estudo foi mais elevada do que as previamente descritas na literatura, 686,7±59,7 µM em TB (43 h) e 822,6±28,1 µM em LB+M9 (63 h). Estes resultados foram obtidos usando a estirpe E. coli BL21 (DE3) que foi a identificada como melhor produtora após produzir 3,7 vezes mais curcumina do que a E. coli K-12 MG1655 (DE3). Além disso, a toxicidade da curcumina para células de E. coli foi avaliada. Os resultados mostraram que concentrações de curcumina acima de 400 µM influenciam negativamente o crescimento de E. coli. Adicionalmente, um dos objetivos do presente trabalho foi construir e validar vários mutantes de E. coli (p. ex., ΔfumA,fumB,fumC) que foram previamente identificados in silico como os mais promissores no sentido de aumentar a produção de curcumina a partir do ácido ferúlico. A deleção do gene fumB do genoma de E. coli K-12 MG1655 (DE3) foi efetuada e resultou numa produção mais rápida de curcumina nas 21 h iniciais, mas após 63 h, a produção de curcumina usando este mutante foi 2,6 vezes mais baixa do que a da estirpe que lhe deu origem. A mesma deleção no genoma de E. coli BL21 (DE3) resultou num decréscimo ainda mais significativo na produção de curcumina. No futuro, é necessário ainda construir o mutante triplo (ΔfumA,fumB,fumC) para avaliar se a produção de curcumina é efetivamente aumentada como previsto in silico

Engenharia de uma via biossintética para produção de glicosaminoglicanos de alto valor em Saccharomyces cerevisiae

Programa doutoral em BioengenhariaGlycosaminoglycans (GAGs), such as hyaluronic acid, heparosan and chondroitin, have emerged as key substances with diverse applications in both the medical and cosmetic industries. Particularly, chondroitin is a crucial polysaccharide with anti-inflammatory properties, mostly used in the treatment of osteoarthritis. Historically, chondroitin has been extracted from animal sources, including shark fins and animal cartilage. However, rising concerns regarding the risks associated with the use of animal-derived products, coupled with the ecological repercussions of overfishing, have been driving the search for sustainable, alternative methodologies for chondroitin production. Inspired by the inherent biosynthetic capabilities of pathogenic strains of Pasteurella multocida and Escherichia coli to produce GAG-like polysaccharides, several studies have sought to use non-pathogenic hosts for the biosynthetic production of chondroitin. The aim of this thesis was to design and engineer an artificial pathway to produce chondroitin in Saccharomyces cerevisiae, due to its well-established status as industrial host organism, its genetic manipulability, and its robust fermentation capabilities. Alternative key genes were carefully curated and evaluated using literature mining and kinetic assays to streamline and optimize the production of chondroitin. The methodologies for bioinformatic metabolic flux prediction and optimization, as well as for the analysis of chondroitin production and quantification have been firstly evaluated and validated in a simpler organism, E. coli. Several targets were identified for under and overexpression that were able to enhance up to 1.9-fold the in vivo chondroitin production in E. coli. Further bioprocess scale-up with a mutant overexpressing lytic murein transglycosylase (mltB) led to 535 mg/L of chondroitin. Subsequently, S. cerevisiae harboring chondroitin production pathways was designed and engineered leading to up to 125 mg/L of chondroitin in flask. These titers might be improved in the future with several under and overexpressions enhancing the precursors availability predicted by the computational approach. This thesis represents a step forward toward a sustainable, cost-effective, and scalable platform for the large-scale production of chondroitin, thereby circumventing the challenges posed by conventional extraction methods and alleviating the environmental and availability concerns associated with animal-sourced chondroitin. Also, the methods herein used can be further applied to other GAG production processes.Os glicosaminoglicanos (GAGs), como o ácido hialurónico, a heparosana e a condroitina, têm emergido como substâncias-chave com diversas aplicações tanto nas indústrias médica como cosmética. Em particular, a condroitina é um polissacarídeo crucial com propriedades anti-inflamatórias, utilizado sobretudo no tratamento da osteoartrite. Historicamente, a condroitina tem sido extraída de fontes animais, incluindo barbatana de tubarão e cartilagem animal. No entanto, preocupações crescentes em relação aos riscos associados ao uso de produtos de origem animal, juntamente com as repercussões ecológicas da sobrepesca, têm impulsionado a busca por metodologias alternativas e sustentáveis para a produção de condroitina. Inspirados pelas capacidades biossintéticas inerentes de estirpes patogénicas de Pasteurella multocida e Escherichia coli na produção de polissacarídeos semelhantes a GAGs, vários estudos têm procurado utilizar hospedeiros não patogénicos para a produção biosintética de condroitina. O objetivo desta tese foi projetar e engenhar uma via artificial para produzir condroitina em Saccharomyces cerevisiae, devido à sua consolidação como organismo hospedeiro industrial, à sua manipulabilidade genética e às suas robustas capacidades de fermentação. Genes-chave alternativos foram cuidadosamente selecionados e avaliados através de pesquisa bibliográfica e ensaios cinéticos para otimizar a produção de condroitina. As metodologias bioinformáticas para previsão e otimização do fluxo metabólico, bem como as de análise e quantificação da produção de condroitina, foram inicialmente avaliadas e validadas num organismo mais simples, E. coli. Vários alvos foram identificados para sub e sobrexpressão que foram capazes de aumentar a produção in vivo de condroitina em até 1.9 vezes. O aumento de escala do bioprocesso com um mutante sobreexpressando murina transglicosilase lítica (mltB) resultou em 535 mg/L de condroitina. Posteriormente, S. cerevisiae contendo vias de produção de condroitina foi projetada e desenvolvida, levando a até 125 mg/L de condroitina em matraz. Esta produção pode ser aprimorada no futuro com várias sub e sobreexpressões para aumentar a disponibilidade de precursores, como previsto pela ferramenta computacional. Esta tese representa um avanço em direção a uma plataforma sustentável, económica e escalável para a produção em larga escala de condroitina, contornando assim os desafios colocados pelos métodos convencionais de extração e aliviando as preocupações ambientais e de disponibilidade associadas à condroitina de origem animal. Além disso, os métodos aqui utilizados podem ser aplicados a outros processos de produção de GAGs.This study was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the scope of the strategic funding of UIDB/04469/2020 unit. I would also like to acknowledge FCT for funding the individual PhD scholarship SFRH/BD/132998/2017 and consequent extension COVID/BD/152454/2022