The chloroplast ATP synthase upon oxidative stress : critical targets of reactive oxygen species

This study examines the impact of reactive oxygen species on enzymatic activity of the chloroplast ATP synthase in situ and in vitro. Isolated spinach thylakoids were shown to be less catalytically active upon treatment with singlet oxygen. It was demonstrated that exposed thylakoids lost their capacity to synthesize and hydrolyze ATP and to acidify the thylakoid lumen in an ATP-dependent manner. A central element of the study was the identification of specific target sites which could be solved in the course of the project. Structural predictions upon enzymatic redox-regulation served as a first platform for this approach. Purification of soluble catalytic CF1 protein revealed that ATPase activity in vitro attenuated by singlet oxygen in a comparable manner to the reaction in situ. With the help of a stepwise disassembly approach it could be shown that initially suggested inter-subunit cross-links between regulatory subunits were not responsible for singlet oxygen-induced loss of activity. Instead, the CF1 gamma subunit seemed to be a promising candidate that harbored functional targets responsible for activity attenuation. In silico analysis proposed a gamma subunit methionine-cysteine cluster to form a highly conserved set of potential targets of various reactive oxygen species. Further mass spectrometry analysis revealed that these residues were susceptible to singlet oxygen and hydrogen peroxide. Several point mutations within in the cluster were analyzed using a recombinant photosynthetic F-ATP synthase assembly system. In an extensive biochemical mutant characterization screen it could be demonstrated that some mutants displayed an aberration of catalytic properties, such as MgADP binding propensity and activity regulation by the gamma subunit redox state. The cluster residues were ascribed to mutually interact while having an effect on remote functional domains within the enzyme. Finally, it could be shown that oxidation of the cluster was responsible for hydrogen peroxide-induced activity attenuation. It is very likely that additional residues participate in singlet oxygen-dependent loss of activity.Gegenstand der Arbeit ist die Untersuchung des Einflusses von reaktiven Sauerstoffspezies auf die Enzymaktivität der plastidären ATP-Synthase in situ und in vitro. An isolierten Thylakoiden aus Spinat wurde eine verminderte katalytische Aktivität nach Kontakt mit Singulett-Sauerstoff gemessen. So konnte gezeigt werden, dass von behandelten Thylakoiden sowohl weniger ATP synthetisiert als auch hydrolysiert wurde. Zudem wiesen die Proben einen eingeschränkten Protonentransport in das Thylakoidlumen nach ATP-Zugabe auf. Die Identifizierung spezifischer Angriffsstellen für reaktive Sauerstoffspezies war zentraler Gegenstand der Studie. Demnach wurde der beobachtete Aktivitätsabfall in Abhängigkeit vom Redoxzustand des Enzyms auf Strukturänderungen zurückgeführt. Die Aufreinigung und Analyse der löslichen CF1-Komponente deutete darauf hin, dass die Aktivitätsabnahme durch Singulett-Sauerstoff in vitro der Abnahme des Enzyms in situ ähnelte. Cross-Links zwischen regulatorischen Untereinheiten von CF1, die ursprünglich für den Abfall durch Singulett-Sauerstoff verantwortlich gemacht wurden, konnten durch graduelle Demontage ausgeschlossen werden. Besonderheiten, die mittels Strukturmodellanalyse aufgezeigt werden konnten, deuteten darauf hin, dass die gamma Untereinheit von CF1 funktionelle Angriffsziele für Singulett-Sauerstoff enthält. Begleitend dazu ergaben massenspektrometrische Untersuchungen, dass ein konserviertes Cluster in der gamma Untereinheit, bestehend aus Methioninen und Cystein, durch Singulett-Sauerstoff und Wasserstoffperoxid oxidiert wurde. Eine Analyse entsprechender Punkt-Mutationen an den Zielaminosäuren erfolgte in einem Assemblierungssystem von rekombinanten Untereinheiten aus photosynthetischen ATP-Synthasen. So konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Mutanten katalytische Veränderungen aufwiesen, wie beispielsweise Bindungsstärke von MgADP oder Redox-Regulierung der Enzymaktivität. Es wurden dabei Hinweise für Interaktionen innerhalb des Clusters gefunden. Zudem hatte die interagierende Gruppe an Aminosäuren weitreichende Einflüsse auf funktionelle Strukturen im Enzym. Letztendlich wurde die wesentliche Zielsetzung der Studie erfüllt, indem mittels der Mutanten gezeigt werden konnte, dass eine Oxidation der postulierten Angriffsziele in der gamma Untereinheit durch Wasserstoffperoxid zur Aktivitätsabnahme beitrug. Gleiches galt für Singulett-Sauerstoff, jedoch deuten die Daten auf ein Zusammenspiel mit weiteren Resten hin