TRANSFERT DE GENE PAR UN VECTEUR NON VIRAL COMPOSE D'UNE SEQUENCE DE CIBLAGE DES INTEGRINES ET D'UN LIPOSOME CATIONIQUE (EFFICACITE ET DEVENIR INTRACELLULAIRE)

UN DES BUTS DE LA THERAPIE GENIQUE EST D'INTRODUIRE DANS UNE CELLULE UN GENE-MEDICAMENT AFIN DE CORRIGER UN DYSFONCTIONNEMENT DE SON PROGRAMME GENETIQUE. CETTE NOUVELLE THERAPEUTIQUE NECESSITE, LA PLUPART DU TEMPS, LA MISE AU POINT D'UNE VECTORISATION AFIN DE TRANSPORTER CE GENE-MEDICAMENT DANS LA CELLULE. NOUS AVONS AINSI MONTRE, DANS UN MODELE DE CELLULES TRACHEALES HUMAINES, UNE AUGMENTATION SPECIFIQUE D'UN FACTEUR 10 DE L'EXPRESSION D'UN PLASMIDE (ADNP) CODANT POUR LE GENE RAPPORTEUR LUCIFERASE LORSQUE CELUI-CI EST CONDENSE PAR UN PEPTIDE CYCLIQUE SPECIFIQUE DES INTEGRINES, COMPRENANT UNE SEQUENCE POLYLYSINE-ARG-GLY-ASP (K 1 6RGD). L'ADDITION D'UN LIPIDE CATIONIQUE AU COMPLEXE ADNP:K 1 6RGD PERMET D'OBTENIR DES NIVEAUX D'EXPRESSION COMPARABLES A CEUX OBTENUS AVEC UN ADENOVIRUS, EN AMELIORANT L'EFFICACITE DU VECTEUR D'UN FACTEUR 30. CE LIPOPOLYPLEXE (ADNP:K 1 6RGD : LIPIDE) PENETRE DANS LA CELLULE PAR ENDOCYTOSE MEDIEE PAR LES INTEGRINES, IMPLIQUANT LES PUITS RECOUVERTS DE CLATHRINE. L'AUGMENTATION DE L'EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR LUCIFERASE, EN PRESENCE DU LIPIDE, EST CORRELEE AVEC UNE AUGMENTATION DU PASSAGE DE L'ADNP DANS LES ENDOSOMES/LYSOSOMES, UNE DIMINUTION DE L'EXOCYTOSE DE L'ADNP ET UN MEILLEUR TRANSFERT NUCLEAIRE. LE TRAFIC INTRACELLULAIRE NECESSITE UNE FUSION ENDOSOMALE ET UN ENVIRONNEMENT VESICULAIRE ACIDE EST BENEFIQUE A L'EFFICACITE DU VECTEUR LIPIDIQUE. LE PASSAGE DE L'ADNP A TRAVERS L'ENVELOPPE NUCLEAIRE SERAIT UN MECANISME ACTIF IMPLIQUANT LES PORES NUCLEAIRES ET NE NECESSITANT PAS L'APPORT D'ELEMENTS CYTOSOLIQUES. LE LIPOPOLYPLEXE PEUT TRANSFECTER DES CELLULES QUIESCENTES MAIS SON ACTIVITE EST MULTIPLIEE PAR QUATRE SUR DES CELLULES EN MITOSE. DES ETUDES IN VIVO CHEZ LA SOURIS NOUS ONT PERMIS D'ETABLIR QUE L'HEMOGLOBINE MASQUAIT LA DETECTION DE L'ACTIVITE LUCIFERASE. UNE PERFUSION APPROPRIEE DES ORGANES PERMETTANT D'EXTRAIRE L'HEMOGLOBINE S'IMPOSE ALORS, AFIN DE DETERMINER L'EXPRESSION IN VIVO DU GENE RAPPORTEUR LUCIFERASE. CES TRAVAUX PARTICIPENT A L'AMELIORATION DES CONNAISSANCES DEVANT PERMETTRE A TERME, UNE OPTIMISATION DES VECTEURS NON VIRAUX NECESSAIRE A L'OBTENTION D'ESSAIS CLINIQUES CONCLUANTS.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocCentre Technique Livre Ens. Sup. (774682301) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Gene transfer by adenovirus-mimetic peptides in the presence of a cationic lipid and/or adenovirus. Analysis of the contribution of the viral and nonviral components

International audiencePeptide and cationic lipid-based gene transfer vectors have shown promise for gene therapy but are still less efficient than viral gene transfer vectors. We have examined the mechanism of gene transfer of different adenovirus-mimetic peptides in the presence and absence of a cationic lipid, lipofectamine and/or adenovirus with the aim of improving the design of nonviral vectors for efficient gene transfer. Three polylysine-adenovirus-mimetic peptides were synthesised and examined for their efficacy for gene transfer. Transfection levels in four cell lines: adenovirus permissive human tracheal epithelial (56FHTE8o(-)), human lung carcinoma (A549), human colon carcinoma (Caco-2) cells, and adenovirus low-permissive Chinese hamster ovary (CHO) cells, were examined. The polylysine-adenovirus-mimetic peptides increased the level of transfection of a reporter transgene in all cell lines. Transfection was substantially increased when an adenovirus was added to cells after pre-incubation with the vector complexes. Formulation of the peptide vector complexes with lipofectamine increased their transfection efficacy and the subsequent addition of an adenovirus increased transfection levels even further but only in permissive cells. Pre-incubation of cells with lipofectamine-peptide vector complexes increased cell binding of the adenovirus but uptake was only increased in intermediate- or non-permissive cells. The addition of lipofectamine increased transgene expression of a recombinant adenovirus in non-permissive cells but not in permissive cells. Enhancement with an adenovirus of peptide vector gene transfer is probably due to more efficient endosome escape while enhancement of gene transfer by peptide vectors complexed to lipofectamine is due to an increase in cellular binding and/or internalisation of the adenovirus