Concentration of osmoregulated periplasmic glucans (OPGs) modulates the activation level of the RcsCD RcsB phosphorelay in the phytopathogen bacteria Dickeya dadantii

International audienceOsmoregulated periplasmic glucans (OPGs) are general constituents of many Proteobacteria. Synthesis of these oligosaccharides is repressed by increased osmolarity of the medium. OPGs are important factors required for full virulence in many zoo-or phytopathogens including Dickeya dadantii. The phytopathogen enterobacterium D. dadantii causes soft-rot disease on a wide range of plant species. The total loss of virulence of opg-negative strains of D. dadantii is linked to the constitutive activation of the RcsCD RcsB phosphorelay highlighting relationship between this phosphorelay and OPGs. Here we show that OPGs control the RcsCD RcsB activation in a concentration-dependent manner, are required for proper activation of this phosphorelay by medium osmolarity, and a high concentration of OPGs in planta is maintained to achieve the low level of activation of the RcsCD RcsB phosphorelay required for full virulence in D. dadantii

Relation entre structure et fonctions des glucanes périplasmiques osmorégulés chez les Protéobactéries

Les glucanes périplasmiques osmorégulés (OPG) sont des composants intrinsèques de l'enveloppe des Protéobactéries. Rhodobacter sphaeroides produit des OPG cycliques [bêta]-1,2 avec une liaison [alpha]-1,6 qui peuvent être substitués par des résidus de succinyle et d'acétyle. L'inactivation du gène opgC par insertion de transposon conduit à la production d'OPG neutres dépourvus de la substitution par les résidus de succinyle. En amont d'opgC et organisés en opéron avec celui-ci, trois gènes, opgGIH, ont été identifiés ; ces gènes sont nécessaires à la synthèse du squelette glucanique. Les protéines OpgG et OpgH présentent de fortes similitudes avec les produits des gènes qui gouvernent la synthèse des OPG linéaires branchés [bêta]-1,2, [bêta]-1,6 chez les Entérobacteries. L'expression hétérologue des gènes opgIHC chez Escherichia coli induit la synthèse de glucanes linéaires de plus grande taille et partiellement substitués par des résidus de succinyle. L'entérobacterie phytopathogène, Erwinia chrysanthemi, synthétise des OPG substitués par des résidus de succinyle et d'acétyle. Cette substitution dépend des conditions de culture. Les mutants déficients dans la synthèse des OPG présentent un phénotype pléiotrope (sécrétion réduite d'exo-enzymes, sensibilité aux sels biliaires, motilité réduite) et ne sont plus virulents. Ces phénotypes ont permis d'isoler des pseudo-révertants. Les mutations additionnelles restaurent à divers degrés le comportement de la souche sauvage.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Caractérisation des populations de Listeria monocytogenes dans la filière poisson fumé (étude de la variabilité génétique et influence de la matrice sur l'expression de la virulence)

La faible prévalence des cas de listériose humaine au regard du pourcentage observé de contamination des poissons fumés, conduit à s'interroger sur les raisons de ce décalage apparent. Un premier axe de recherche s'est orienté sur l'étude de la variabilité et de la virulence des souches présentes dans cette filière. La diversité génétique appréciée par pulsotypage a permis de montrer que le hareng et le saumon ne sont pas contaminés de façon significative par les mêmes groupes génétiques se caractérise par une hypovirulence. À contrario, les génotypes associés au saumon sont communément isolés dans diverses filières de l'agro-alimentaire. Cette différence de profil de contamination entre ces deux espèces de poisson pourrait être reliée à la domestication du saumon. Les résultats ne confortent donc pas l'idée que les poissons fumés soient contaminés par un type particulier de L. monocytogenes. Les investigations se sont poursuivies sur un axe plus novateur visant à vérifier l'impact de la matrice poisson fumé sur l'expression de la virulence. Des tests de croissance et de génotoxicité montrent que le poisson fumé n'est pas un véhicule neutre pour la bactérie et influence sensiblement son phénotype. D'autre part, les composés de la fumée semblent jouer un rôle en modifiant le niveau de virulence déterminé in vitro.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

La biosynthèse des glucanes périplasmiques osmorégulés (de la démonstration des gènes impliqués chez Pseudomonas aeruginosa à l'analyse structurale de protéines impliquées chez Escherichia coli)

Chez Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae et Escherichia coli, l'opéron opgGH code les deux protéines indispensables à la synthèse des OPG. Une première approche a permis de montrer que c'est le locus opgGH et non le locus ndvB qui est responsable de la synthèse des OPG chez Pseudomonas aeruginosa, L'absence d'OPG perturbe la formation des biofilms. Les OPG de P. aeruginosa sont constitués de 5 à 10 résidus de glucose formant un squelette linéaire lié en b-1,2 avec des branches liées en b-1,6. Ces OPG sont très semblables à ceux trouvés chez E. coli, Chez cette bactérie OpgH, une glucosyltransférase de type 2 située dans la membrane interne, catalyse la biosynthèse du squelette linéaire à partir de l'UDP-glucose OpgG, une protéine périplasmique, interagirait avec OpgH pour la synthèse du squelette et aurait un rôle dans la formation des branches. Chez E. coli, OpgD, le produit d'un paralogue d'opgG, contrôlerait la machinerie de biosynthèse des OPG. Les mutants opgG ne forment plus d'OPG, les mutants opgD ont des OPG de structure altérée. Etant donné les fortes similitudes dans leur séquence primaire, nous avons entrepris de cristalliser OpgG et OpgD afin de mettre en évidence des différences structurales pour comprendre le rôle de ces deux protéines. Les cristaux d'OpgD obtenus diffractent avec une trop faible résolution pour obtenir une carte de densité électronique. La structure tridimensionnelle d'OpgG (établie par Hanoulle et al. en 2004) et les stratégies de mutagenèse localisée, dirigée et de délétion menées dans ce travail ont permis de montrer qu' OpgG interagit avec les autres constituants du complexe enzymatique et participe à la formation des branches.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Biosynthèse des glucanes périplasmiques osmorégulés chez Escherichia colis (analyse fonctionnelle des protéines MdoG et MdoH et caractérisation de deux nouvelles activités)

Les glucanes périplasmiques osmorégulés (OPG) sont présents chez toutes les Protéobactéries testées, où ils peuvent représenter jusqu'à 5% du poids sec de la bactérie. Leur biosynthèse est d'autant plus importante que l'osmolarité du milieu est faible. Les OPG d'E. coli sont formés d'une chaîne linéaire de résidus de glucose liés en b-1,2 et ramifiés par des résidus de glucose liés en b-1,6. Ces OPG peuvent être substitués par des résidus de phosphoglycérol, de succinate et de phosphoéthanolamine. Un opéron de deux gènes (mdoGH) soumis à une régulation osmotique est nécessaire à la biosynthèse du squelette glucosidique. Trois types de mutagenèse (dirigée, ou par greffage d'épitope aléatoire ou localisée) ont été effectués sur cet opéron dans le but d'établir une topologie fonctionnelle de ces deux protéines. Ces mutagenèses ont révélé la présence dans MdoH de deux domaines cytoplasmiques actifs, l'importance d'une boucle périplasmique et la stricte nécessité de 3 résidus d'acide aspartique, conservés dans les glycosyltransférase de la famille 2, Cette approche a aussi révélé l'importance des 80 derniers acides aminés de la protéine MdoG dans sa fonction. Un gène mdoD, paralogue du gène mdoG, est impliqué dans la biosynthèse du squelette glucosidique mais n'est pas indispensable. L'expression du gène mdoD, étudiée grâce à des fusions traductionnelles, est maintenue à un niveau de base en phase exponentielle et augmentée lors de l'entrée en phase stationnaire et de l'adaptation à une haute osmolarité. L'expression du gène mdoD dépend des facteurs de transcription s70 et sS et d'un régulateur inconnu. Le produit du gène mdoB responsable de l'activité phosphoglycérol-transférase II périplasmique. Nos études indiquent que le transfert du succinate s'effectue simultanément à la biosynthèse du squelette glucosidique et de manière plus tardive et séquentielle pour les résidus de phosphoglycérol.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Rôle du périplasme dans la perception par la bactérie de son environnement (utilisation des ß-galactanes par Erwinia chrysanthemi)

Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsable de la formation d'une pourriture molle sur un large spectre de plantes hôtes. Sa virulence dépend principalement de la sécrétion d'exoenzymes (dont les pectinases et cellulases) qui vont dégrader la paroi des cellules végétales. L'objectif de cette thèse est de participer à la compréhension du rôle du périplasme dans la perception de l'environnement par la bactérie. Nous avons caractérisé génétiquement et biochimiquement le locus gan codant 9 protéines impliquées dans le transport et la dégradation des ß-galactanes (un des composants de la pectine). Les OPG (glucanes périplasmiques osmorégulés) sont essentiels pour la virulence d'E. chrysanthemi puisqu'un mutant opgG incapable de les synthétiser présente un phénotype pléïotrope dont la perte de virulence. Une mutation suppressive de la mutation opgG localisée dans le gène rcsC a été obtenue au laboratoire. Nous avons voulu préciser le rôle du système à deux composants RcsCDB dans le pouvoir pathogène de la bactérie. La mutation rcsC2 conduit à une diminution de la phosphorylation du régulateur RcsB due à une augmentation de l'activité phosphatase de RcsC. Pourtant RcsB n'est pas essentielle pour la virulence. Nous avons également montré que l'expression des gènes régulés par le système RcsCDB est influencée par la quantité des OPG. Une faible surexpression d'une version soluble de RcsF engendre une activation du système Rcs et que la faible surexpression de DjlA et IgaA n'a pas d'effet significatif. Enfin, nous avons entrepris de caractériser la structure de RcsF par mutagenèse dirigée.Erwinia chrysanthemi is a phytopathogenic enterobacterium causing soft rot disease in a wide range of plant species. The maceration of plant tissues is essentially caused by the secretion of a set of plant cell wall degrading enzymes (including pectinases and cellulases). The aim is to participate to the understanding of the role of the periplasm in environment perception by bacteria. We characterised genetically and biochemically the gan locus encoding 9 proteins involved in galactan transport and catabolism (galactan is a pectic component). Osmoregulated periplasmic glucans (OPGs) are essential for E. chrysanthemi pathogenicity. An opgG mutant lacks OPGs and shows a pleiotropic phenotype including nonvirulence. A rcsC point mutation (rcsC2) suppresses the phenotype induced by OPGs defect. We wanted to clarify the role of the Rcs system in pathogenicity. The rcsC2 mutation leads to the reduction of transcriptional activity of RcsB caused by an increase of phosphatase activity of RcsC. Mutations in RcsCDB proteins show that RcsB is not essential to virulence. We have shown that genes expression regulated by RcsCBD phosphorelay is influenced by the quantity of OPGs in the periplasm. An ectopic overexpression of a soluble version of RcsF leads to a RcsCDB phosphorelay activation, while an ectopic overexpression of DjlA and IgaA has no significatives effects. Finally, we have characterized RcsF structures by site-directed mutagenesis and deletion mutagenesis.LILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF

Contribution à l'analyse du pouvoir pathogène d'Erwinia chrysanthemi

LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Impact des mutations OPG chez Erwinia chrysanthemi (recherche de suppresseurs et analyse protéomique des mutants)

Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène pectinolytique faisant partie de la subdivision g des protéobactéries. Elle infecte un large spectre de plantes hôtes engendrant la pourriture molle. L'apparition de cette pourriture molle dépend de la synthèse et de la sécrétion d'une batterie d'exoenzymes (cellulases, protéases et pectate-Iyases) capable de dégrader les composants de la paroi des cellules végétales. Néamnoins, l'expression de nombreux autres gènes est nécessaire à la virulence de cette bactérie. En effet, les mutants déficients en glucanes périplasmiques osmorégulés (OPG) d'E. chrysanthemi sont totalement non virulents. Les OPG sont constitués de 5 à 12 résidus de glucose liés en b,1-2, branchés en b,1-6 et sont d'autant plus abondants que l'osmolarité du milieu est faible. Ces mutants présentent un phénotype pléïotrope: ils sont hypersensibles aux sels biliaires, la synthèse d'exopolysaccharides est augmentée, la synthèse et la sécrétion d"exo-enzymes ainsl que la motilité sont réduites. Un phénotype similaire, mais atténué, est observé chez les mutants du système ToI. Les OPG comme les protéines ToI apparaissent nécessaires au maintien de l'intégrité de l'enveloppe. Des mutations suppressives restaurant la motilité des mutants opg ont été isolées. Elles rétablissent l'essentiel du phénotype sauvage (virulence sur tubercules de pommes de terre, sécrétion des exo-enzymes, résistance aux sels biliaires, colonies redevenues non muqueuses et motilité, à l'exception de la virulence sur feuille d'endive). Une des mutations identifiées rcsC2 supprime également les phénotypes des mutants toI.Cette mutation rcsC2 affecte un système capteur-régulateur rcsBCD impliqué dans la régulation de gènes cibles en réponse à un ou des signaux de nature inconnue et nécessaire au pouvoir pathogène des bactéries chez les animaux et chez les plantes. Les fonctions des gènes cibles régulés par ce système, correspondent pour une grande part aux fonctions altérées par l'absence d'OPG chez E. chrysanthemi. Ces résultats nous laissent penser que les OPG pourraient être une des molécules captées par le système RscBCD. De plus, en parallèle à cette étude, une analyse protéomique comparative du mutant opgG par rapport à la souche sauvage d'E. chrysanthemi, nous a permis de mettre en évidence une altération importante des fonctions cellulaires allant des structures de l'enveloppe qui était notre seule hypothèse quant à l'impact de l'absence d' OPG, mais nous constatons également une altération d'expression des protéines du métabolisme énergétique, de certains systèmes de transport et de protémes impliquées dans la dégradation et la conformation des protéines souvent induites en réponse à divers stress. L'ensemble de ces résultats nous laisse penser que les OPG pourraient être des molécules captées par un jeu de systèmes à deux composants afin de permettre à la bactérie de répondre à une multitude de stress rencontrés dans l' environnement.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Identification of mdoD, an mdoG Paralog Which Encodes a Twin-Arginine-Dependent Periplasmic Protein That Controls Osmoregulated Periplasmic Glucan Backbone Structures

Osmoregulated periplasmic glucans (OPGs) of Escherichia coli are anionic and highly branched oligosaccharides that accumulate in the periplasmic space in response to low osmolarity of the medium. The glucan length, ranging from 5 to 12 glucose residues, is under strict control. Two genes that form an operon, mdoGH, govern glucose backbone synthesis. The new gene mdoD, which appears to be a paralog of mdoG, was characterized in this study. Cassette inactivation of mdoD resulted in production of OPGs with a higher degree of polymerization, indicating that OpgD, the mdoD product (according to the new nomenclature), controls the glucose backbone structures. OpgD secretion depends on the Tat secretory pathway. Orthologs of the mdoG and mdoD genes are found in various proteobacteria. Most of the OpgD orthologs exhibit a Tat-dependent secretion signal, while most of the OpgG orthologs are Sec dependent