КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО β-ГАЛАКТОЗИДАЗУ БАКТЕРИЙ ARTHROBACTER SULFONIVORANS

A full nucleotide sequence of the β-galactosidase gene (β-gal) was deciphered by cloning in plasmid pJET1.2 of DNA fragments containing β-gal of bacteria Arthrobacter sulfonivorans LF-GAL, their subsequent sequencing and comparison with the known sequences from the GenBank database. It was deposited under access number KM2778940.The evaluation of the β-gal structure showed that it is composed of 3132 b.p. encoding 1043 amino acids making up a β-galactosidase subunit with a molecular weight of 113.6 kDa. It was found that β-gal of the examined strain is characterized by the highest degree of similarity to the genes encoding β-galactosidase in the genus Arthrobacter (66–72 %).The amino acid composition of enzyme proteins from A. sulfonivorans LF-GAL matches that of other representatives of the genus Arthrobacter by 59–95 %. The analysis of the enzyme protein amino acid sequence by BLAST software package demonstrated that β-galactosidase of A. sulfonivorans LF-GAL comprises conservative sequences typical for glycosyl hydrolase family 2.Путем клонирования в составе плазмиды pJET1.2 фрагментов ДНК, содержащих ген β-галактозидазы (β-gal) бактерий Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ, их последующего секвенирования и сравнения с известными последовательностями из базы данных GenBank установлена и депонирована (код доступа KM277894) полная нуклеотидная последовательность гена β-gal.Анализ структуры β-gal бактерий A. sulfonivorans ЛФ-ГАЛ показал, что он состоит из 3132 п. н., которые кодируют 1043 аминокислоты, составляющие субъединицу β-галактозидазы с молекулярной массой 113,6 кДа. Установлено, что β-gal исследуемого штамма в наибольшей степени идентичен генам, кодирующим β-галактозидазы у актинобактерий рода Arthrobacter (66–72 %). Соответствие аминокислотного состава ферментных белков A. sulfonivorans ЛФ-ГАЛ и других представителей рода Arthrobacter составляет 59–95 %.Анализ аминокислотной последовательности ферментного белка в пакете программ BLAST показал, что β-галактозидаза A. sulfonivorans ЛФ-ГАЛ содержит консервативные последовательности, характерные для гликозил-гидролаз 2 семейства

СРАВНИТЕЛЬНАЯ КИНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОСТА ШТАММОВ ARTHROBACTER SULFONIVORANS И СИНТЕЗА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

The data are presented on kinetic correlations of the growth of parent and lactose-adapted strains of bacteria Arthrobacter sulfonivorans and the production of extracellular beta-galactosidase. It was found that the adapted strain BIM B-499-D was distinguished by a shorter lag phase than the parent strain BIM B-2242 by a reduced period of reaching a maximum specific growth rate (μmax = 0.316–0.319 h–1) and a stationary phase of culture. Synthesis of extracellular enzyme in both strains occurred during the exponential growth phase and attained a peak specific rate (εmax = 0.247–0.250 U · mg–1 · h–1) with a 6 h time interval. BIM B-499-D exceeds BIM B-22421.6 times in the level of enzyme biosynthesis and in the duration of the process – 1.3 times. The kinetic parameters of growth (tµmax = 6–9 h) and beta-galactosidase production (tεmax = 18–24 h) established for the examined strains indicate the disconnection of processes in time at least by 12–15 h.  Представлены данные, характеризующие рост исходного БИМ В-2242 и адаптированного к лактозе БИМ В-499-Д штаммов бактерий Arthrobacter sulfonivorans и синтеза ими внеклеточной бета-галактозидазы. Установлено, что адаптированный штамм характеризуется более короткой, чем исходный штамм, лагфазой, раньше достигает максимальной удельной скорости роста (μmax = 0,316–0,319 ч–1) и стационарной фазы развития. Синтез вне-клеточного фермента у обоих штаммов протекает в экспоненциальной фазе роста и достигает одинаковой максимальной удельной скорости (εmax = 0,247–0,250 ед · мг–1 · ч–1) со сдвигом, составляющим 6 ч. При этом штамм БИМ В-499-Д по уровню синтеза фермента в 1,6 раза превосходит штамм БИМ В-2242 при меньшей в 1,3 раза длительности процесса. Кинетические параметры роста (tµmax = 6–9 ч) исследуемых штаммов и образования ими бета-галакто-зидазы (tεmax = 18–24 ч) указывают на разобщенность процессов во времени не менее чем на 12–15 ч. 

Выделение, характеристика и молекулярно-генетическая идентификация нового штамма бактерий Paenibacillus species

Bacterial variant PS-K-17 was isolated from wheat grain contaminated by polysaccharide-producing microbiota for further characterization. It was found that the isolate grown on agar slants and in submerged culture on media with specific substrates synthesized beta-galactosidase, amylase, protease, pectinase, cellulase, beta-glucanase, lipase (esterase), alginase, extracellular polysaccharides, and pigments, probably carotenoids. Based on cultural-morphological and physiological-biochemical properties and phylogenetic analysis of nucleotide sequences of 16S rRNA gene (access code MF443394 in GenBank) the bacterial culture was identified as Paenibacillus species PS-K-17. The studied isolate forms one phylogenetic branch with type strains Paenibacillus nicotianae (98.3 %), Paenibacillus hordei (98.2 %), Paenibacillus kyungheensis (97.9 %), holding wherein a separate position. Strain Paenibacillus sp. PS-K-17 may find use in biotechnology as a producer of extracellular polysaccharides and enzymes splitting plant polymeric substances as well as a component of microbial consortium-ingredient of a new complex feed additive.Из зерна пшеницы, контаминированного образующей полисахарид микрофлорой, выделена и охарактеризована культура бактерий ПС-К-17. Установлено, что изолят на агаризованных средах и в глубинной культуре со специфическими субстратами синтезирует бета-галактозидазу, амилазу, протеазу, пектиназу, целлюлазу, бета- глюканазу, липазу (эстеразу), альгиназу, а также внеклеточные полисахариды и пигменты, возможно, каротиноиды. На основании культурально-морфологических и физиолого-биохимических особенностей, а также филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (код доступа MF443394 в GenBank) бактериальная культура идентифицирована как Paenibacillus species ПС-К-17. Исследуемый изолят образует одну филогенетическую ветвь с типовыми штаммами Paenibacillus nicotianae (98,3 %), Paenibacillus hordei (98,2 %), Paenibacillus kyungheensis (97,9 %), в пределах которой занимает обособленное положение. Штамм Paenibacillus sp. ПС-К-17 может найти применение в биотехнологии как продуцент внеклеточных полисахаридов и ферментов, расщепляющих растительные полимеры, а также как компонент микробного консорциума в составе новой кормовой добавки комплексного действия

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ РОДА ARTHROBACTER И ИХ ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Two-stage screening enabled one to define the composition of enzyme complexes produced by bacteria of genus Arthrobacter in media with specific substrates and activity of individual constituents involved in the t ransformation of milk proteins, lipids and carbohydrates. It was found that enzyme complexes of Arthrobacter strains BIM B-2239, BIM B-2240, BIM B-2241 and BIM B-2242 showed the most balanced activity of lipase, protease, β-galactosidase and glucose(xylose)isomerase components. Following the nucleotide sequence analysis of 16S rRNA gene the examined cultures were identified as Arthrobacter sulfonivorans. 16S rRNA gene sequences over 1400 bp in size were deposited in GenBank database.Detailed investigation of conditions favoring the efficient hydrolysis of proteins and lipids by proteases and lipases produced by Arthrobacter sulfonivorans strains BIM B-2239, BIM B-2240, BIM B-2241, BIM B-2242 and the transformation of milk lactose and derived hydrolysis products mediated by β-galactosidases and glucose(xylose)isomerases will allow one to select microbial strain to develop the biotechnology of manufacturing hypoallergenic feed additive with prebiotic activity from dairy substrates.В результате двухступенчатого скрининга определены состав ферментных комплексов, продуцируемых бактериями рода Arthrobacter в средах с о с пецифическим субстратом, и а ктивность и х о тдельных компонентов, участвующих в трансформации белков, жиров и углеводов молока. Установлено, что наиболее сбалансированными по активности одновременно липаз, протеаз, β-галактозидаз и глюкозо(ксилозо)изомераз являются ферментные комплексы штаммов БИМ В-2239, БИМ В-2240, БИМ В-2241 и БИМ В-2242 Arthrobacter sp.Методом анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК указанные бактериальные культуры идентифицированы как Arthrobacter sulfonivorans. Последовательности их генов 16S рРНК протяженностью более 1400 п. о. депонированы в базе данных GenBank.Детальное исследование условий эффективного гидролиза белков и жиров с участием продуцируемых штаммами БИМ В-2239, БИМ В-2240, БИМ В-2241 и БИМ В-2242 Arthrobacter sp. липаз и протеаз, а также трансформации лактозы молока и продуктов ее гидролиза с участием β-галактозидаз и глюкозо(ксилозо)изомераз позволит отобрать штамм-продуцент для разработки биотехнологии получения из молочного сырья гипоаллергенной биологически активной кормовой добавки пребиотического действия

Biosynthetic features and properties of xylose isomerases from Arthrobacter nicotianae, Escherichia coli, and Erwinia carotovora subsp

Abstract -The characteristics of xylose isomerase biosynthesis in the bacteria Arthrobacter nicotianae BIM B-5, Erwinia carotovora subsp atroseptica jn42xylA , and Escherichia coli HB101 xylA have been studied. The bacteria produced the enzyme constitutively. Out of the carbon sources studied, D -glucose and D -xylose were most favorable for the biosynthesis of xylose isomerase in E. carotovora subsp. atroseptica , but the least appropriate in terms of the enzyme production efficiency in E. coli . Minimum and maximum levels of xylose isomerase formation in A. nicotianae were noted, respectively, during D -xylose and sucrose utilization. An addition to the D -xylose-containing nutrient medium of 0.1-1.5% D -glucose did not affect the enzyme synthesis in A. nicotianae , but suppressed it in Erwinia carotovora subsp. atroseptica (by 7% at the highest concentration) and Escherichia coli (by 63 and 75% at concentrations of 0.1 and 1.0%, respectively). The enzyme proteins produced by the bacteria exhibited the same substrate specificity and electrophoretic mobility (PAGE) as xylose isomerase A. nicotianae , although insignificant differences in the major physicochemical properties were noted