一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用

本发明公开了一种一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用。利用质粒HSP702-GFP和THX-HGFP,通过PCR和酶切连接等方法构建中间载体TH-HGFP；利用质粒TH-HGFP、PET23a-GST和pCDNA3.1-FLAG,通过PCR和酶切连接等方法分别构建中间载体TH-HIS-HGFP、TH-GST-HGFP和TH-FLAG-HGFP；利用上述中间载体分别与质粒pD5H8,通过PCR和酶切连接等方法构建四膜虫表达载体：pD5H8-HGFP,pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST-HGFP,pD5H8-FLAG-HGFP。该系列载体均含有绿色荧光筛选标记HGFP,可用于重组子的高通量筛选；该系列载体可替代盒式结构HGFP两侧均含反向的I-SceI稀有酶切位点,引入外源基因时,将带I-SceI接头的外源基因片段与用I-SceI处理后的该系列载体一步连接,即可得到含外源基因的四膜虫表达载体。本发明操作方便快捷,引入外源基因的四膜虫表达载体转染四膜虫后可实现外源基因的高效表达

嗜热四膜虫五个hsp70基因的表达分析

鉴定得到嗜热四膜虫13个含有完整保守结构域的hsp70基因,对其中5个高度相似且无内含子的hsp70基因进行表达分析。在37、39和41℃热激条件下,实时荧光定量PCR结果表明,hsp70-2基因对热激响应最敏感。在四膜虫生长、饥饿和接合生殖这3种生理或发育状态下,Microarray结果显示,hsp70-4基因恒定且高表达;在热激条件下,hsp70-4基因的表达水平随着温度的升高而略微增加,证实hsp70-4基因为热休克相关蛋白hsc70基因;克隆的hsp70-4基因全长2208bp,开放阅读框长1959bp,编码653个氨基酸。Microarray结果提示,hsp70-3可能参与四膜虫饥饿早期(0～12h)的耐受和接合生殖后期(6～10h)的新大小核形成,老大核凋亡等事件;hsp70-5可能参与四膜虫饥饿晚期(12～15h)的耐受和接合生殖早期(0～6h)的小核减数分裂、小核交换和原核(pronuclear)融合事件。Blast2GO分析表明,与hsp70-3和hsp70-5共表达的基因分别参与不同的生物学过程,进一步反映了hsp70-3和hsp70-5这两个基因在功能上是存在差异的

四膜虫rDNA表达载体的改造及用于异源基因的高效表达

基于四膜虫小核rDNA改造得到的pD5H8载体，在转染进接合生殖时期的四膜虫后能发育成9000～10000拷贝的大核rDNA，因此pD5H8载体是四膜虫异源基因表达的研究热点；但其载体上匮乏合适的克隆位点和无启动子结构阻碍了该载体的进一步发展。本研究在四膜虫启动子HSP70—2和终止子HSP70-I之间，通过稀有酶切位点I-SceI导入细菌绿色荧光蛋白NGFP）这一筛选标记，由此组成的DNA片段（HSP70-25’UTR．I-SceI—HGFP．I—SeeI—HSP70-13’UTR）整合进pD5H8，将之改造成pD5H8-HGFP表达载体。来自真核生物的绿色荧光蛋白（GFP）藉由l-SceI酶切位点一步导入pD5H8一HGFP表达载体后，在四膜虫中大量表达且具有生物学活性。因此，改造后的pD5H8一HGFP表达载体拥有一步法引入异源基因，几乎无酶切位点的限制，有效的筛选标记，高效的异源基因表达能力，以及环境友好、便捷可控等诸多优点，这对于深入开展四膜虫基因功能的过表达研究和开发异源基因在四膜虫这一真核表达系统中的应用奠定了技术基础

嗜热四膜虫五个hsp70基因的表达分析

鉴定得到嗜热四膜虫13个含有完整保守结构域的hsp70基因,对其中5个高度相似且无内含子的hsp70基因进行表达分析。在37、39和41℃热激条件下,实时荧光定量PCR结果表明,hsp70-2基因对热激响应最敏感。在四膜虫生长、饥饿和接合生殖这3种生理或发育状态下,Microarray结果显示,hsp70-4基因恒定且高表达;在热激条件下,hsp70-4基因的表达水平随着温度的升高而略微增加,证实hsp70-4基因为热休克相关蛋白hsc70基因;克隆的hsp70-4基因全长2208bp,开放阅读框长1959bp,编码653个氨基酸。Microarray结果提示,hsp70-3可能参与四膜虫饥饿早期（0～12h）的耐受和接合生殖后期（6～10h）的新大小核形成,老大核凋亡等事件;hsp70-5可能参与四膜虫饥饿晚期（12～15h）的耐受和接合生殖早期（0～6h）的小核减数分裂、小核交换和原核（pronuclear）融合事件。Blast2GO分析表明,与hsp70-3和hsp70-5共表达的基因分别参与不同的生物学过程,进一步反映了hsp70-3和hsp70-5这两个基因在功能上是存在差异的

嗜热四膜虫腺苷三磷酸结合盒转运蛋白ABCC10基因的可变剪切分析

哺乳动物中腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABCT)可通过可变剪切产生多种转录本，其中含有提前终止密码子(premature terminal codon，PTC)的转录本还可与无义介导的mRNA降解通路(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)作用来调节蛋白的相关功能，但这些现象尚未在低等生物的ABCT研究中发现。该文以单细胞原生动物——嗜热四膜虫为对象，利用转录组数据发现ABCC10基因存在可变剪切，并产生两条转录本(SV1和SV2)，其中SV2在第五个内含子处发生内含子保留事件，这段长49 bp的序列使SV2发生移码并产生PTC。在构建NMD通路中关键因子UPF1基因的嗜热四膜虫敲降株的基础上，利用实时荧光定量PCR方法检测SV2的转录情况。结果显示：含有PTC的转录本SV2在UPF1敲降株中的转录水平相对于野生型显著增加，说明SV2可被NMD通路降解。这与高等动物中某些ABCC蛋白通过可变剪切引入含PTC转录本，并能被NMD降解的方式一致，推测该方式在真核生物中十分保守，并在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic commonancestor)中就已形成

四膜虫rDNA表达载体的改造及用于异源基因的高效表达

基于四膜虫小核rDNA改造得到的pD5H8载体，在转染进接合生殖时期的四膜虫后能发育成9000～10000拷贝的大核rDNA，因此pD5H8载体是四膜虫异源基因表达的研究热点；但其载体上匮乏合适的克隆位点和无启动子结构阻碍了该载体的进一步发展。本研究在四膜虫启动子HSP70—2和终止子HSP70-I之间，通过稀有酶切位点I-SceI导入细菌绿色荧光蛋白NGFP）这一筛选标记，由此组成的DNA片段（HSP70-25’UTR．I-SceI—HGFP．I—SeeI—HSP70-13’UTR）整合进pD5H8，将之改造成pD5H8-HGFP表达载体。来自真核生物的绿色荧光蛋白（GFP）藉由l-SceI酶切位点一步导入pD5H8一HGFP表达载体后，在四膜虫中大量表达且具有生物学活性。因此，改造后的pD5H8一HGFP表达载体拥有一步法引入异源基因，几乎无酶切位点的限制，有效的筛选标记，高效的异源基因表达能力，以及环境友好、便捷可控等诸多优点，这对于深入开展四膜虫基因功能的过表达研究和开发异源基因在四膜虫这一真核表达系统中的应用奠定了技术基础

嗜热四膜虫腺苷三磷酸结合盒转运蛋白ABCC10基因的可变剪切分析

哺乳动物中腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABCT)可通过可变剪切产生多种转录本，其中含有提前终止密码子(premature terminal codon，PTC)的转录本还可与无义介导的mRNA降解通路(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)作用来调节蛋白的相关功能，但这些现象尚未在低等生物的ABCT研究中发现。该文以单细胞原生动物——嗜热四膜虫为对象，利用转录组数据发现ABCC10基因存在可变剪切，并产生两条转录本(SV1和SV2)，其中SV2在第五个内含子处发生内含子保留事件，这段长49 bp的序列使SV2发生移码并产生PTC。在构建NMD通路中关键因子UPF1基因的嗜热四膜虫敲降株的基础上，利用实时荧光定量PCR方法检测SV2的转录情况。结果显示：含有PTC的转录本SV2在UPF1敲降株中的转录水平相对于野生型显著增加，说明SV2可被NMD通路降解。这与高等动物中某些ABCC蛋白通过可变剪切引入含PTC转录本，并能被NMD降解的方式一致，推测该方式在真核生物中十分保守，并在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic commonancestor)中就已形成

嗜热四膜虫腺苷三磷酸结合盒转运蛋白ABCC10基因的可变剪切分析

哺乳动物中腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABCT)可通过可变剪切产生多种转录本，其中含有提前终止密码子(premature terminal codon，PTC)的转录本还可与无义介导的mRNA降解通路(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)作用来调节蛋白的相关功能，但这些现象尚未在低等生物的ABCT研究中发现。该文以单细胞原生动物——嗜热四膜虫为对象，利用转录组数据发现ABCC10基因存在可变剪切，并产生两条转录本(SV1和SV2)，其中SV2在第五个内含子处发生内含子保留事件，这段长49 bp的序列使SV2发生移码并产生PTC。在构建NMD通路中关键因子UPF1基因的嗜热四膜虫敲降株的基础上，利用实时荧光定量PCR方法检测SV2的转录情况。结果显示：含有PTC的转录本SV2在UPF1敲降株中的转录水平相对于野生型显著增加，说明SV2可被NMD通路降解。这与高等动物中某些ABCC蛋白通过可变剪切引入含PTC转录本，并能被NMD降解的方式一致，推测该方式在真核生物中十分保守，并在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic commonancestor)中就已形成

副溶血性弧菌群中规律成簇间隔短回文重复序列的比较分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是大多数细菌和古细菌在生存压力下进化出的一套抵抗噬菌体干扰的防御系统。本研究主要采用生物信息学的方法,对24株分离自人体且已完成全基因组测序的副溶血性弧菌内CRISPR结构进行了分析,结果发现:只有16株细菌包含1个及以上的CRISPR结构,共计29个CRISPR;仅11个具有真座位特征的CRISPR结构含有前导序列;CRISPR结构中的重复序列所形成的RNA二级结构具有一大一小共两环或一大二小共三环的特征;目前未找到与区间序列高度同源的外源遗传物质;仅含前导序列的CRISPR结构侧翼区才存在cas基因。副溶血性弧菌的CRISPR结构可能以水平基因转移的方式整合到细菌的染色体中,CRISPR结构不适合作为细菌分类的一项指标

副溶血性弧菌群中规律成簇间隔短回文重复序列的比较分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)是大多数细菌和古细菌在生存压力下进化出的一套抵抗噬菌体干扰的防御系统。本研究主要采用生物信息学的方法,对24株分离自人体且已完成全基因组测序的副溶血性弧菌内CRISPR结构进行了分析,结果发现:只有16株细菌包含1个及以上的CRISPR结构,共计29个CRISPR;仅11个具有真座位特征的CRISPR结构含有前导序列;CRISPR结构中的重复序列所形成的RNA二级结构具有一大一小共两环或一大二小共三环的特征;目前未找到与区间序列高度同源的外源遗传物质;仅含前导序列的CRISPR结构侧翼区才存在cas基因。副溶血性弧菌的CRISPR结构可能以水平基因转移的方式整合到细菌的染色体中,CRISPR结构不适合作为细菌分类的一项指标