石斑鱼微孢子虫的体液免疫及抗原性初步研究

微孢子虫是一类细胞内寄生虫,尽管对其归属尚有争议,但大都将其纳入原虫的范畴。鱼类寄生微孢子虫在我国鲜有报道,暴发性疾病更是少有,但近来有报道因其寄生造成广东沿海一带石斑鱼养殖的严重经济损失。为尽快建立可行的检测及防疫措施。我们对自然感染的鱼体进行了初步研究,以证明该病原体的感染是否

圆形碘孢虫完整孢子ELISA的建立

探索建立鱼类寄生圆形碘孢虫(Myacobolus rotuzudus Nemezek，1911，Myxosporea，Bivalvulida)完整孢子酶联免疫吸附试验(Enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)检测的可行性，对丙酮、戊二醛、甲醛、多聚甲醛、乙醇等几种常用固定剂应用于此方法的效果进行评价，初步建立了针对鱼类黏孢子虫的完整孢子ELISA检测模式。结果显示，同比其他几种固定剂，2％的多聚甲醛、0．25％的戊二醛对圆形碘孢虫完整孢子ELISA有较好的效果，经二者固定后，最低可检出10个成熟的完整孢子，这为筛选鱼类黏孢子虫孢子表面抗原分子的特异性配体，如单克隆抗体及基因工程抗体或抗体片断，分析其表面分子性质奠定了基础。同时，讨论了该方法在鱼类黏孢子虫病原检测、属种鉴定、系统发育及黏孢子虫基础生物学研究等方面的潜在应用价值

圆形碘孢虫完整孢子ELISA的建立

探索建立鱼类寄生圆形碘孢虫(MyxobolusrotundusNemezek,1911,Myxosporea,Bivalvulida)完整孢子酶联免疫吸附试验(Enzyme linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测的可行性,对丙酮、戊二醛、甲醛、多聚甲醛、乙醇等几种常用固定剂应用于此方法的效果进行评价,初步建立了针对鱼类黏孢子虫的完整孢子ELISA检测模式。结果显示,同比其他几种固定剂,2%的多聚甲醛、0 25%的戊二醛对圆形碘孢虫完整孢子ELISA有较好的效果,经二者固定后,

洪湖碘泡虫sybrgreen实时荧光定量pcr检测方法的建立及其应用

洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)引起的鲫&ldquo;喉孢子虫病&rdquo;严重危害我国异育银鲫养殖。病原丰度是决定病害发生的最重要因素之一,因此建立洪湖碘泡虫的定量检测方法,不仅可用于异育银鲫&ldquo;喉孢子虫病&rdquo;的早期诊断,也可应用于养殖系统中洪湖碘泡虫的定量监测,为该病的暴发风险预警及防控措施的效果评价提供技术手段。研究根据洪湖碘泡虫的ITS基因序列,设计合成一对特异性引物HHF/R,建立了洪湖碘泡虫的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性及应用性进行了验证。结果显示,该方法能特异性检测出洪湖碘泡虫,而与多涅茨尾孢虫、倪李碘泡虫、普洛宁碘泡虫、吴李碘泡虫之间无交叉反应;最低检测限为3.02&times;10~1copies/&mu;L,灵敏性较常规PCR高出1000倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法可定量检出洪湖碘泡虫全生活史阶段,包括鱼体内移行发育的前孢子阶段及养殖系统环境,如池塘水样及底泥样品中分布的洪湖碘泡虫。因此,所建立的洪湖碘泡虫SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性稳定,可应用于异育银鲫全养殖阶段洪湖碘泡虫的定性、定量监测。</p

武汉单极虫生活史中放射孢子虫的发现及鉴定

鲫养殖中粘孢子虫病非常严重,为掌握其病原的感染传播途径,实验通过粘孢子虫生活调查研究,在底栖寡毛类苏氏尾鳃蚓体内发现了一种放射孢子虫。该放射孢子虫的孢子无孢柄;孢体顶面观和侧面观都呈近卵圆形,长(19.8±1.3)μm,宽(18.2±1.1)μm;3个极囊梨形,呈点状聚集分布在孢体顶端,极囊长(4.53±0.4)μm,宽(3.4±0.4)μm;3个尾柄几乎等长,刺状,从孢体基部向下伸展,尾柄间夹角>100°,尾柄长(195.0±15.7)μm,宽(11.5±0.8)μm。根据形态特征将其划归为橘瓣放射孢子虫集合类群。18S r DNA序列分析表明该放射孢子虫与鲫体表寄生武汉单极虫为同一物种,序列相似率为99.8%~100%。序列系统发育分析进一步发现单极虫类群中多数种类的放射孢子虫阶段主要寄生在苏氏尾鳃蚓体内。本研究首次发现和报道了鲫寄生武汉单极虫生活史中寡毛类宿主及其放射孢子虫的形态特征,为鲫粘孢子虫病生态防控提供重要的基础资料

武汉单极虫生活史中放射孢子虫的发现及鉴定

鲫养殖中粘孢子虫病非常严重,为掌握其病原的感染传播途径,实验通过粘孢子虫生活调查研究,在底栖寡毛类苏氏尾鳃蚓体内发现了一种放射孢子虫。该放射孢子虫的孢子无孢柄;孢体顶面观和侧面观都呈近卵圆形,长(19.8±1.3)μm,宽(18.2±1.1)μm;3个极囊梨形,呈点状聚集分布在孢体顶端,极囊长(4.53±0.4)μm,宽(3.4±0.4)μm;3个尾柄几乎等长,刺状,从孢体基部向下伸展,尾柄间夹角>100°,尾柄长(195.0±15.7)μm,宽(11.5±0.8)μm。根据形态特征将其划归为橘瓣放射孢子虫集合类群。18S r DNA序列分析表明该放射孢子虫与鲫体表寄生武汉单极虫为同一物种,序列相似率为99.8%~100%。序列系统发育分析进一步发现单极虫类群中多数种类的放射孢子虫阶段主要寄生在苏氏尾鳃蚓体内。本研究首次发现和报道了鲫寄生武汉单极虫生活史中寡毛类宿主及其放射孢子虫的形态特征,为鲫粘孢子虫病生态防控提供重要的基础资料

南海石斑鱼苗种肠道微孢子虫病病原的鉴定

研究通过组织病理分析、超微结构观察以及分子特征分析对石斑鱼(Epinephelus spp.)苗种肠道微孢子虫病病原进行了鉴定。其为一肠孢虫属新种,命名为石斑鱼肠孢虫(Enterospora epinepheli sp.n.),专性寄生于细胞核内,发育过程与肠孢虫属模式种黄道蟹肠孢虫(Enterospora canceri)一致。早期单核裂殖体通过一层简单的电子薄膜与宿主细胞核质隔离。随后,单核裂殖体发育形成多核裂殖原质团。此时,细胞核出现明显肥大,有的甚至被裂殖子胀破。裂殖原质团进一步发育形成多核产孢体,并开始出现许多高电子密度的囊泡状结构。这些与极丝及锚状盘有关的囊泡状结构聚集在藕核周围,并组装形成微孢子虫特征性结构(挤出装置)前体。随后,产孢体原生质团通过连续分裂形成一个个孢子母细胞。孢子母细胞与细胞核直接接触,并直接发育形成成熟孢子。成熟孢子椭圆形,孢子长(1.56±0.31)μm(1.07—1.96μm),宽(1.08±0.98)μm(0.93—1.28μm)。孢壁分为3层,外壁电子密度高,厚(15.51±0.95)nm(9.87—26.18 nm),内壁为电子透明层,较外层更厚(81.13±2.71)nm(57.16—110.81 nm),最里面为孢质膜。极丝为同型极丝,共5—6圈,分2排排列。组织病理学分析发现该微孢子虫寄生于肠道上皮杯状细胞核内,肠壁脱落的内容物中也发现大量的微孢子虫。序列比对发现该种与之前报道的石斑鱼肠道微孢子虫待定种(Microsporidium sp.)序列基本一致,与其他相似性较高的种类的遗传距离在0.162—0.225。系统发育关系分析显示肠胞虫科的种类明显分为两支,石斑鱼肠孢虫和肠孢虫属其他种类及毕氏肠胞虫聚为一个独立分支,但不与该分枝中任何种类形成姊妹支

用Percoll试剂和DEAE-纤维素层析柱分离纯化鳝锥虫

用51%的Percoll分离液和DEAE-纤维素层析柱,从自然感染的黄鳝(Monopterus albusZuiew)中分离鳝锥虫(Trypanosoma monopteriChen et Hsieh,1964)。对含虫血液样品分别以2.1&times;103r/min、2.5&times;103r/min、2.9&times;103r/min、3.3&times;103r/min、3.6&times;103r/min离心5、10、15、20min,观察红细胞的去除和鳝锥虫存留百分数,结果表明:2.9&times;103r/min离心15min分离效果最佳。离心分离的混悬液