人工和天然雌核发育鱼类的生化遗传学研究

本研究在了解和综述人工和天然雌核发育鱼类及其相关研究的现状和进展的基础上，以所在实验室在人工雌核发育鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)和天然雌核发育银鲫(Carassius auratus gibelio)研究方面的前期工作为起点，主要利用生物化学方法开展了人工和天然雌核发育鱼类的遗传标记鉴定和发育调控机制问题等研究。研究内容主要包括两个方面。一是选择同工酶为分子标记指标，对两个人工雌核发育二倍体鲢鱼群体进行了遗传相似性和多态性比较分析，从生化遗传角度考察了各个雌核发育鲢鱼群体之间的遗传多样性，进而评价了人工雌核发育操作技术对鲢鱼群体遗传结构的影响。结果表明，各个雌核发育鲢鱼群体内不同个体间的酶谱表现出很大程度的一致性，具较高的纯合度，而不同雌核发育群体之间表现有明显差异。特别是肝脏、肌肉和血细胞中的酯酶谱带以其稳定的差异，建议作为区分不同人工雌核发育鲢鱼群体的生化遗传标记。二是以雌核发育银鲫的两性亲缘种彩鲫(Carassius auratuscolor variety)作为对照，从生化分析入手，对银鲫精子、卵壳以及卵子提取物等进行了分级分离等研究。首先，通过分级抽提得到精液的不同组份精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等，然后经不同的凝胶电泳系统，比较银鲫精子和彩鲫精子相应组份可溶性蛋白成分的差异。研究表明，经分级抽提的银鲫精子和彩鲫精了的各个组份都含有其特定的蛋白谱带。两种鱼精头膜的可溶性蛋白在SDS-PAGE电泳图谱上基本一致，而在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上则具有各自的特征性谱带。鞭毛可溶性蛋白的SDS-PAGE分析在雌核发育银鲫中揭示出一条特异的蛋白带。脱膜精头的可溶性蛋白在SDS-PAGE电泳图谱上差异明显，存在几条特征性蛋白带，并经Acid-Urea PAGE系统分析表明，这些特征性蛋白为碱性蛋白。接着，以雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫的成熟卵为材料，分离卵壳，经处理得到卵壳可溶性蛋白组分。SDD-PAGE梯度凝胶电泳分析揭示出了雌核发育银鲫的特征性蛋白谱带。最后，借鉴非细胞体系(cell-free systems)的研究方法，制备了雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫成熟卵子的抽提液，采用不同电泳系统对天然雌核发育银鲫和两性融合生殖彩鲫卵子抽提液中的蛋白成分进行比较分析。结果表明，虽然抽提液中蛋白质成分多而复杂，在SDS-PAGE胶上分辨不出相互之间的差异，但在非变性梯度凝聚电泳图谱上则各存在有一组差异的蛋白谱带，银鲫差异蛋白谱带的迁移率快于彩鲫差异蛋白谱带。后经P11和DE52离子交换柱以及CHT亲和柱层析等步骤，纯化得到雌核发育银鲫的差异蛋白。该蛋白经SDS-PAGE胶电泳和考马斯亮蓝显色表现为一条带，在经2D-PAGE胶电泳也表现为一个单点，表明该蛋白已被纯化，其分子量约为22 kDa。用该蛋白制备的多抗所进行的Western印迹也进一步证明该蛋白为雌核发育银鲫所特有。同时，经热变性处理研究表明，卵子抽提液经85 ℃变性处理20 min，其绝大部分蛋白被变性沉淀，上清液经55％(NH_4)_2SO_4饱和沉淀后，可分离到热稳定蛋白。该热稳定蛋白经12％SDS-PAGE胶电泳分离，呈现出分子量分别大于100 kDa和约29 kDa的两条蛋白带。经同等条件下获得的电泳图谱和Western印迹分析表明，从卵子抽提液中纯化的银鲫差异蛋白和热稳定蛋白为两种含量较高而又不同的蛋白因子。生化分析进一步表明，银鲫差异蛋白既不是糖蛋白，也不是磷蛋白，同时脂类蛋白显色也为阴性。雌核发育银鲫差异蛋白经氨基酸测序确定了其12个氨基酸肽段序列，用据此设计的引物，从银鲫卵母细胞cDNA文库中克隆出了其全长cDNA，并从彩鲫卵母细胞cDNA文库中也克隆出了与该差异蛋白基因同源的全长cDNA。通过同源基因查询和结构预测，确定它们均属于C型凝集素(lectin)蛋白家族中的成员，同时揭示出可能与雌核发育调控相关的一些差异特征，如银鲫的差异蛋白比彩鲫的同源蛋白少一个跨膜区。Western印迹和RT-PCR分析进一步揭示银鲫的差异蛋白在卵母细胞中特异表达，并经免疫荧光定位初步将其定位于卵膜上

两个雌核发育白鲢群体同工酶分析及遗传标记的确定

取源于武汉两个不同渔场两尾白鲢的卵子，经紫外照射遗传物质失活的鲤鱼精子刺激雌核发育和热休克诱导第二极体保留的基因组操作技术，获得了两个不同的人工雌核发育白鲢群体。采用聚丙烯酰胺垂直板电泳技术，分析了这两个不同人工雌核发育白鲢群体（分别称为Hy－G1和Hy－G2）内不同个体的肝脏、肌肉组织以及红细胞中乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）、酯酶（EST）、超氧化物歧化酶（SOD）等几种同工酶的表达谱式，并与普通繁殖的同龄白鲢进行了比较。结果表明，各个雌核发育白鲢群体内不同个体间的酶谱表现出很大程度的

两个雌核发育白鲢群体同工酶分析及遗传标记的确定

取源于武汉两个不同渔场两尾白鲢的卵子，经紫外照射遗传物质失活的鲤鱼精子刺激雌核发育和热休克诱导第二极体保留的基因组操作技术，获得了两个不同的人工雌核发育白鲢群体。采用聚丙烯酰胺垂直板电泳技术，分析了这两个不同人工雌核发育白鲢群体（分别称为Hy－G1和Hy－G2）内不同个体的肝脏、肌肉组织以及红细胞中乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）、酯酶（EST）、超氧化物歧化酶（SOD）等几种同工酶的表达谱式，并与普通繁殖的同龄白鲢进行了比较。结果表明，各个雌核发育白鲢群体内不同个体间的酶谱表现出很大程度的

雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫精子蛋白组份的比较研究

对雌核发育银鲫和两性融合彩鲫精子蛋白组份进行了比较分析。通过分级抽提得到精子的不同组份精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等，然后经不同的凝胶电泳系统，比较分析了银鲫精子和其两性亲缘种彩鲫精子相应组份可溶性蛋白成份的差异。研究表明，经分级抽提的银鲫精子和彩鲫精子的各个组份都含有其特定的蛋白谱带。精浆蛋白在两种鱼之间和两种鱼的不同个体之间都存在一定差异。精头膜、鞭毛和脱膜精头的可溶性蛋白在同种鱼不同个体间高度一致，但在两种鱼之间表现出差异。两种鱼精头膜的可溶性蛋白在SDS－PAGE电泳图谱上基本一致，而在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上则具有各自的特征性谱带。鞭毛可溶性蛋白的SDS－PAGE分析在雌核发育银鲫中揭示出一条特异的蛋白带。脱膜精头的可溶性蛋白在SDS－PAGE电泳图谱上差异明显，存在几条特征性蛋白带，并经Acid-Urea PAGE系统分析，证实这些特征性蛋白为碱性蛋白。这些发现为进一步鉴定雌核发育银鲫雄鱼精子的特异性蛋白和揭示其分子机制打下了基础

雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫精子蛋白组份的比较研究

对雌核发育银鲫和两性融合彩鲫精子蛋白组份进行了比较分析。通过分级抽提得到精子的不同组份精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等 ,然后经不同的凝胶电泳系统 ,比较分析了银鲫精子和其两性亲缘种彩鲫精子相应组份可溶性蛋白成份的差异。研究表明 ,经分级抽提的银鲫精子和彩鲫精子的各个组份都含有其特定的蛋白谱带。精浆蛋白在两种鱼之间和两种鱼的不同个体之间都存在一定差异。精头膜、鞭毛和脱膜精头的可溶性蛋白在同种鱼不同个体间高度一致 ,但在两种鱼之间表现出差异。两种鱼精头膜的可溶性蛋白在SDS PAGE电泳图谱上基本一致 ,

雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫精子蛋白组份的比较研究

对雌核发育银鲫和两性融合彩鲫精子蛋白组份进行了比较分析。通过分级抽提得到精子的不同组份精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等，然后经不同的凝胶电泳系统，比较分析了银鲫精子和其两性亲缘种彩鲫精子相应组份可溶性蛋白成份的差异。研究表明，经分级抽提的银鲫精子和彩鲫精子的各个组份都含有其特定的蛋白谱带。精浆蛋白在两种鱼之间和两种鱼的不同个体之间都存在一定差异。精头膜、鞭毛和脱膜精头的可溶性蛋白在同种鱼不同个体间高度一致，但在两种鱼之间表现出差异。两种鱼精头膜的可溶性蛋白在SDS－PAGE电泳图谱上基本一致，而在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上则具有各自的特征性谱带。鞭毛可溶性蛋白的SDS－PAGE分析在雌核发育银鲫中揭示出一条特异的蛋白带。脱膜精头的可溶性蛋白在SDS－PAGE电泳图谱上差异明显，存在几条特征性蛋白带，并经Acid-Urea PAGE系统分析，证实这些特征性蛋白为碱性蛋白。这些发现为进一步鉴定雌核发育银鲫雄鱼精子的特异性蛋白和揭示其分子机制打下了基础

雌核发育银鲫与两性生殖彩鲫卵壳蛋白组分的比较分析及其受精前后的变化

以雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫的成熟卵为材料 ,分离卵壳 ,经处理得到卵壳可溶性蛋白组分。SDS -PAGE梯度凝胶电泳分析在雌核发育银鲫中揭示出3条较明显的差异蛋白带。同时 ,采用相同处理方法对受精前后卵壳蛋白组分进行比较分析后发现 ,这些差异蛋白带在受精后发生了变化 ,其带纹表现为减弱或消失 ,表明这些差异蛋白可能与受精过程相关

雌核发育二倍体白鲢不同群体间血细胞酯酶与血清转铁蛋白多态性研究

利用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳技术,对1997年和1998两年得到的三个雌核发育二倍体白鲢群体(分别称为HyG971、HyG972和HyG98)以及两个普通繁殖白鲢群体HH97、HH98血细胞酯酶和血清转铁蛋白的多态性进行了比较分析.在5个白鲢群体中,血细胞酯酶共检测到4个基因位点,其中3个位点具有多态性;转铁蛋白由一个基因位点的5个等位基因控制,每对纯合的等位因素对应三条蛋白带.在统计每一个体对应位置酶带或蛋白带有无(用“1、0”表示)的基础上,利用RAPDPLOT统计软件计算群体内个体间以及群体间的遗传距离.通过聚类分析发现,HyG971、HyG972和HyG98之间具有明显的遗传差异,HyG971和HyG972间的遗传距离为0.3667,HyG972和HyG98间的遗传距离为0.2981,HyG971和HyG98间的遗传距离为0.2537

雌核发育银鲫和两性融合彩鲫卵母细胞体外诱导成熟过程中周期蛋白合成和MPF活性变化的比较研究

采用体外诱导卵母细胞成熟技术 ,比较研究了雌核发育银鲫和两性融合发育彩鲫卵母细胞成熟过程中周期蛋白合成和MPF活性变化情况。结果表明 :1 7α ,2 0 β 二氢孕酮(简称DP)浓度为 0 5μg/ml,温度为 2 4℃ ,光照时间 2 0小时为最适诱导条件。在相同条件下 ,两性生殖彩鲫卵母细胞体外诱导成熟速度明显快于银鲫。相应的细胞学研究表明 ,在体外诱导时 ,银鲫和彩鲫卵母细胞的发育成熟是正常的。银鲫卵母细胞生发泡破裂 (GVBD)时已有周期蛋白的合成 ,但生发泡破裂开始后则呈现合成速度下降直至没

银鲫和彩鲫卵母细胞c-型凝集素的鉴定、特征及其功能分析

借鉴非细胞体系(cell-free systems)的研究方法;制备了雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫成熟卵子的抽提液;采用不同电泳系统对银鲫和彩鲫卵子抽提液中的蛋白成分进行比较分析。结果表明;虽然抽提液中蛋白质成分多而复杂;在SDS-PAGE胶上分辨不出相互之间的差异;但在非变性梯度凝聚电泳图谱上则各存在有一组差异的蛋白谱带;银鲫差异蛋白谱带的迁移率快于彩鲫差异蛋白谱带。后经P11和DE52离子交换柱以及CHT亲和柱层析等步骤;纯化得到一个银鲫的差异蛋白。该蛋白经SDS-PAGE胶电泳和考马斯亮蓝显色表现为一条带;在经2D-PAGE胶电泳也表现为一个单点;表明该蛋白已被纯化;其分子量约为22kDa。纯化的蛋白经氨基酸测序确定了其12个氨基酸肽段序列;用据此设计的引物;从银鲫卵母细胞cDNA文库中克隆出了其全长cDNA;并从彩鲫卵母细胞cDNA文库中也克隆出了与该差异蛋白基因