Studies of the microbicidal effect of Vespa venom and Chinese herbal extracts on clinical pathogens

針對臨床上細菌之抗藥性菌株，期望以天然物蜂毒（venom）及中草藥為標的，開發出新的抗菌物質為目標來進行。因此，本研究分為黃腰虎頭蜂（Vespa affinis）毒液和中草藥萃取液兩大部分，分別進行抗菌活性研究分析。研究一為黃腰虎頭蜂工蜂毒液應用於臨床抗藥性細菌之抗菌活性研究，其毒液呈清澈淡黃色，pH值介於5到6之微酸性液體，蛋白質濃度約為16.3 mg/ml到39.4 mg/ml，且富含多種具生物活性的分子。以改良過的柯鮑二氏法（Kirby-Bauer method）測試細菌對蜂毒之感受性，結果顯示革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對於黃腰虎頭蜂蜂毒皆具有強烈的抗菌效能。進一步利用高效液相層析管柱（Phenomenex LunaR C18(2) 5μm）純化，可將毒液分離為6個明顯區段，其中僅有區段5具有抗菌活性。再利用Phenomenex JupiterR 5 μm C4 300 A管柱，可將區段5分離出fraction 5-1 和5-2兩個區段，經敏感性測試顯示fraction 5-1具抗菌活性。Fraction 5-1經快速原子撞擊法質譜儀（fast-atom-bombardment mass spectrometer）測得其分子量為1512.96 Da，胺基酸序列定序結果顯示其為14個胺基酸分子組成之胜肽，進一步依胺基酸序列設計核酸引子，可自基因組（genome）解讀其基因序列，並證實此胜肽歸屬於肥大細胞脱粒肽（mastoparan）系列，並將此胜肽命名為肥大細胞脱粒肽-AF（mastoparan-AF），此研究結果顯示黃腰虎頭蜂毒液中短鏈胜肽mastoparan-AF具有抗菌活性。研究二鑒於市面上動物皮膚疾病之藥浴治療產品多含化學物質，恐有藥物殘留與抗藥性細菌產生之虞，故利用傳統醫學使用之抗微生物中草藥應用於動物抗藥性細菌皮膚病藥浴治療之開發。各中草藥分別以水與醇類萃取後所得之萃取物，對於動物臨床常見引起皮膚感染之細菌與黴菌，進行藥物敏感性測試試驗，篩選出旋覆花（Inula japonica Thunb.）、川烏（Aconitum carmichaeli Debx.）、草烏（A. kusnezoffii Reichb.）等中草藥萃取物具有抑菌活性。中草藥萃取物進一步輔以適當界面活性劑經小型量產製成半成品後，用於具皮膚病徵之分組試驗犬隻，觀察並予以統計其各階段之藥效。動物試驗四週後，實驗組患犬皮膚狀況分級指數分別為1.14、0.71、1.57，皆優於對照組患犬之皮膚分級指數2。研究成果顯示黃腰虎頭蜂毒液之mastoparan-AF及旋覆花、川烏、草烏等中草藥萃取物，均對臨床抗藥性細菌具有抗菌活性。未來經量產製程之調整，進一步結構蛋白之分析與詳細生物活性之探究，為下一個目標。The study is aimed to measure the antibacterial activity of polypeptide isolated from Vespa affinis venom and Chinese herbal extracts. The venom from V. affinis is a clear and light-yellow liquid with pH range 5 to 6. The protein concentration of the venom is 16.3 to 39.4 mg/ml. A strong antibacterial activity of vespa venom for gram positive and negative bacteria is founded by the Kirby-Bauer method. This venom can be separated as six fractions which are analyzed by using reverse phase High-performance liquid chromatography (HPLC), SDS-PAGE, and fast-atom- bombardment mass spectrometer, but the fraction 5 has antibacterial activity. The fraction 5 can be divided into the fraction 5-1 and the fraction 5-2 but only the fraction 5-1 with the molecular weight of 1512.96 Dalton, showed an antibacterial activity. After forth advanced analysis, the fraction 5-1 composed of 14 amino acids is classified as mastoparan-AF, the main composed of antibacterial compound from the V. affinis venom. Based on the chemical toxicity of shampoo used for pets, the second aim of this study is to evaluate the effects of herbal extracts on bacterial pathogens of clinical cases to evaluate a potential shampoo for the pet use. The antibacterial activity of crude extracts of 22 herbs were founded to be against 7 bacteria and 4 fungi. The therapeutic effects of crude alcoholic extracts of Inula japonica Thunb., Aconitum carmichaeli Debx. and A. kusnezoffii Reichb. on canine skin diseases were studied and an excellent antibacterial activity was founded compared with the control group. In conclusion, mastoparan-AF from the V. affinis venom and alcoholic extracts of I. japonica Thunb., A. carmichaeli Debx., and A. kusnezoffii Reichb. showed strong antibacterial activity. Finally, more study is needed to determine the structural of this protein and it’s bioactivity.第壹章　緒 言 1 第貳章　臨床抗藥性菌株之解決對策－虎頭蜂毒抗菌成分的分析、純化、抗菌活性之測試 3 壹、 摘要 3 貳、 文獻探討 4 一、 肥大細胞脫粒肽（mastoparan） 4 （一） 來源與結構 4 （二） 生物活性 4 二、 抗菌胜肽的作用機制與肥大脫粒肽之抗菌研究 9 三、 抗菌胜肽對真核細胞之選擇性毒性 10 四、 肥大細胞脫粒肽類似物之抗菌研究 12 五、 肥大細胞脫粒肽抗菌活性之開發前景 12 參、 材料與方法 13 一、 試驗用虎頭蜂 13 二、 虎頭蜂毒液採集性狀測定（PH值、蛋白質濃度） 13 三、 胜肽純化 14 四、 抑菌環（Zone of inhibition）試驗 15 五、 蛋白質電泳分析 15 六、 蛋白質之分子量測定 15 七、 蛋白質之胺基酸定序 15 八、 合成mastoparan-AF之抗菌活性與溶血性測定 15 （一） Mastoparan AF之合成 15 （二） 合成mastoparan-AF之抗菌活性（minimum inhibition concentration, MIC；minimum bactericidal concentration, MBC） 15 （三） 合成mastoparan-AF之溶血性測定 17 九、 Scanning electron microscopy （SEM）觀察mastoparan AF 對hemolytic E. coli臨床分離菌株之作用 18 （一） 菌液準備 18 （二） 操作方法 18 十、 Mastoparan-AF之cDNA之選殖與定序 18 肆、 結果與討論 19 一、 黃腰虎頭蜂毒之一般性狀 19 二、 抗菌成分之測定 19 三、 胺基酸定序及質譜儀分析 22 四、 mastoparan-AF之抗菌活性與溶血性 22 五、 SEM觀察mastoparan-AF對hemolytic E. coli之作用 24 六、 Mastoparan-AF之cDNA 24 伍、 參考文獻 26 第参章　臨床抗藥性菌株之解決對策；中草藥抗菌成分的開發與犬皮膚病外用治療洗劑之開發 31 壹、 摘要 31 貳、 背景分析與實驗設計 32 一、 背景分析 32 二、 實驗設計 38 （一） 方法及進行步驟 38 1 中草藥活性成分之萃取 38 2 臨床病原分離菌株準備與抗菌活性之試驗 39 3 萃取物對於患有皮膚疾病動物之治療效果評估 41 參、 結果 43 一、 萃取中草藥活性成分 43 1 各萃取液之最終濃縮保存濃度 43 2 萃取物抑制細菌之活性測試 43 3 萃取物抑制黴菌之活性測試 43 4 小型量產試驗品 43 5 萃取物試驗品對於患有皮膚疾病動物之治療效果評估 43 肆、 討論 45 伍、 參考文獻 62 第肆章　結論 6

The Investigation of Deer Parasite in Taiwan

就本島地區鹿隻內寄生蟲種類之鑑定分析，除可獲知現況外，亦可監控人畜共通寄生蟲病原之狀況及兩岸是否有所關連。主要工作將採集各鹿場鹿隻糞材共350個進行寄生蟲相調查，結果可以提供防治對策之重要參考數據。Throgh isolating and identifying of endoparasites from deers in Taiwan, the information of current endoparasite infections status will be confirmed and also analyze the connection of pathogenic endoparasites of mainland China. The program will focus on collecting and monitoring the endoparasites infection deers by examing the deer feces from deer farm, totally 350 feces samples will be collected. The acquired result could provide as important information for formulating disease prevention policies

Isolation of mycoplasmas from bovine milk and study of their role in bovine mastitis in middle Taiwan

臺灣迄今未有從牛乳中分離Mycoplasma之報告。為明瞭Mycoplasma在臺灣乳牛乳房中 有否Mycoplasma之感染與發生牛乳房炎之關係，除應用Candle joor 培養方法，以M- odified hayflick medium 從個別牛分房前搾乳（quarter foremilk），總乳（bul- k milk），臨床乳房炎乳分離Mycoplasma之外，以及探討Mycoplasma分離結果與乳房 炎間之關係，另外分別測定個別牛分房前搾乳中體細胞，PH值，加里福尼亞乳房炎 試驗（Califonia Mastitis Test, CMT）等級，並分離其他乳房炎之一般病原細菌。 由結果顯示，從７個牧場共７４０個乳樣分離出３０株Mycoplasma，只有一場是陰性 ，其中經生化試驗與血清學試驗，鑑定菌型結果Mycoplasma bovigenitalium ３株， Mycoplasma group７共７株，其他Mycoplasma spp. ２０株。CMT（－）１例 （1），CMT(+)１例（1 ），CMT(++)６例（6），CMT(+++)２２ 244 208 154 例（22）。所以Mycoplasma分離與CMT，PH值，體細胞數及臨床性乳房炎結果成 134 正相關。與細菌混合感染者佔２１例（２１／３０），單純由Mycoplasma感染者９例 （９／３０），單獨感染與細菌混合感染臨床上之病原性並無明顯差異，其中與E. coli , staphylococcus aureus混合感染共３例（３／３０）Staphylococcus aure- us, Streptococcus SPP 混合感染共４例（４／３０），單純由Staphylococcus au- reus混合感染５例（５／３０）Streptococcus spp.５例（５／３０），E. coli １ 例（１／３０）Klebsiellas spp.例（１／３０），Corynebacterium pyogen１例（ １／３０），Pseudomonas aureuginosa １例（１／３０）。經此結果分析Mycopla- sma 的分離結果，與臺灣乳牛乳房炎之發生有關

An Analysis of Vertical Coordination Strategies in Taiwan Swine Industry

養豬事業為台灣畜牧事業中產值最大的一項，且自1986年起，產值超過稻米，而為農業產總產值中最大項農產品，豬肉又為國人最重要的動物性蛋白質來源。由於養豬產值每年平均佔農業產值的百分之二十，佔畜牧產值的百分之六十。由上可知養豬產業為國內最重要的農村經濟產業之一(表1-1-1)。 而在台灣成為豬口蹄疫疫區之後，國內豬肉消費量驟降，市場被迫暫時關閉，而於市場恢復開放初期，每公斤成交價格，跌落至新台幣12元的歷史低價。從國內養豬產業的觀點來看，口蹄疫事件不獨使年產值達900億養豬產業損失慘重，同時也使得和養豬產業相關的關聯產業(飼料，藥品，種畜，屠宰，分切，加工，銷售等)蒙受重大損失。 接踵而來，為了因應未來我國加入WTO組織，政府業己對美承諾付出入會前所謂之頭期款，即每年自美進口豬腹脅肉5000公噸和豬雜碎7500公噸。雖然入會前配額進口之腹脅和雜碎豬肉數量不多，但心理影響所造成市場價格波動，己經非常深遠。再者國內肉豬市場供給原本己大過需求，而進口豬肉的相繼進來，使得國內養豬產業的經營更形困難，因為其所要面對的是生產成本較低，更具競爭力的進口豬肉。一些規模較小的養豬戶，養豬成本無法降低，勢必無法與國外進口的豬肉競爭，甚至較大規模的養豬戶，在一時之間無法調適的情況之下，也無法負擔如此大的競爭壓力而面臨關廠的命運。 台灣在歷經豬隻口蹄疫事件之後，及未來加入WTO 之衝擊，養豬產業該何去何從呢?根據Coase(1937)與Williamson(1975)所提出有關的交易成本理論，我們可以歸納出在下列幾項情況之下，垂直協調策略可能被採行: 1.生產技術互相依賴程度高時。 2.商品或零件品質不易辨識時。 3.品牌，聲譽的價值高，搭便車行為容易發生時。 4.生產技術迂迴程度高，生產流程不易彈性調整時。 5.外部環境不確定程度高時。 綜合上述的各項條件，本研究針對整個養豬產業的大環境做評估，探討台灣地區的養豬產業各個階段(飼料，飼養，屠宰，分切，加工，銷售)是否具備垂直協調的條件，進而分析各階段的經營策略，利用垂直協調之經營方式，達到增加銷售通路及銷售收入等目標，以提昇國內養豬產業的總體競爭力。目錄 第一章 緒論1第一節 研究動機1 第二節 研究目的4 第三節 研究範圍與資料來源4 第四節 研究架構5 第二章 理論基礎6 第一節 交易成本理論6 第二節 垂直整合理論15 第三節 農產品產銷的垂直整合19 第三章 文獻探討21 第一節 策略聯盟的定義及目的21 第二節 策略聯盟的類型27 第三節 策略聯盟的優缺點30 第四節 策略聯盟之形成因素及策略企圖31 第五節 策略聯盟之關鍵成功因素34 第四章 研究方法37 第一節 研究工具37 第二節 抽樣方法37 第三節 實施過程38 第四節 資料分析38 第五節 研究分析流程39 第五章 結果分析44 第一節 飼料業者之可行整合策略分析44 第二節 養豬戶之可行整合策略分析55 第三節 肉品市場之可行整合策略分析63 第四節 冷凍肉品加工廠之可行整合策略分析69 第五節 銷售業者之可行整合策略分析76 第六章 結論與建議86 第一節 研究限制86第二節 結論86 第三節 建議89 參考文獻: 中文部份90 英文部份9

Establishment a Rapid Diagnostic Method for Cryptococcus spp.

建立快速檢測鳥禽類糞便中隱球菌病原的方法,並探討進口鳥類之地區與國家疫病情形與建立實際基本資料,提供給相關主管單位備以作為參加WTO之談判籌碼與施政參考,並對進口的鳥禽類嚴加把關,確保國人公共衛生的安全建立自鳥禽類糞便中快速檢測隱球菌病原的方法,對進口的鳥禽類嚴加把關,確保國人公共衛生的安全.The main purpose is to establih a rapid method of diagnosis for Cryptococcu spp.. Additionally, the basic informations about areas or countries of imported birds are also collected in the study. The results may be provided as references for WTO issue negotiation and policy. Also, the quarantine and public health may be protected by the rapid methods for about Cryptococcu pathogens

Development and Application of Antimicrobial Polypeptide

虎頭蜂蜂毒蛋白(mastoparan)為14 個胺基酸所組成之小分子胜肽，目前已知mastoparan 具有抗細菌、病毒及抗腫瘤生長之特性，又該胜肽對於抑菌作用具有選擇性（針對革蘭氏陰性菌或陽性菌）。有鑑於目前抗生素在人醫及獸醫方面的廣泛使用，具有多重抗藥性菌株種類愈來愈多，利用小分子胜肽併用抗生素之使用以達到有益之協同作用已為未來發展的目標。本計畫將使用台灣產黃腰虎頭蜂(Vespa affinis)蜂毒蛋白具有抗菌活性之mastoparan 以真核系統表現，以期最佳之大量表現方法，後將已製成之mastoparan 進行動物試驗並評估mastoparan 抗菌及其保護效果，期以產品用於疾病防治與飼料添加劑之應用。The mastoparan isolated from the venom of hornets is a small polypeptide containing 14amino acids, which has been proven having selective antimicrobial (Gram negative orpositive bacteria), antiviral and anti-tumor growth activity. Base on widespread using ofantibiotics in human and veterinary medicine, more and more bacteria has multipleantimicrobial activities and hard to be eliminated. Combination of using small polypeptideand common used antibiotics to reach synergistic effect is already became one of researchpurposes in antimicrobial therapy in future. In the purpose of the program, mastoparan(originally isolated from Vespa affinis in Taiwan) was expressed by using eukaryotic systemto reach the maximum expression method. In order to evaluate the antimicrobial andprotective activity of mastoparan, the expressed mastoparan was used in animal model andexpect the product could be used to disease treatment, prevention and further as a feedadditive

Establishment a Rapid Diagnostic Method for Pathogenic Salmonella spp. and Campylobacter spp. from Import Pet Birds

建立快速檢測鳥類糞便中沙氏桿菌及彎曲菌等病原菌的方法，並探討進口鳥類之地區與國家疫病情形與建立實際基本資料，提供給相關主管單位備以作為參加W T O之談判籌碼與施政參考，並對進口的鳥類嚴加把關，確保國人公共衛生的安全建立自鳥類糞便中快速檢測沙氏桿菌及彎曲菌等病原菌的方法，對進口的鳥類嚴加把關，確保國人公共衛生的安全。The main purpose is to establih a rapid method of diagnosis for Samonella spp. and Campylobacter spp.. Additionally , the basic informations about areas or countries of imported birds are also collected in the study. The results may be provided as references for WTO issue negotiation and policy. Also, the quarantine and public health may be protected by the rapid methods for about two pathogens

Determining Milk Quality by Specific Protein of Somatic Cells

Somatic cell count increased in milk is due to the infection of microorganism.Leukocytes proceed into the lumen of mammary alveolar and mix with milk.Milk with high somatic cell count is unfavorable for storage and for further processing.In this study, azurophilic granules in somatic cell will be isolated.At least one kind of anti-microbial protein will be purified.Antibody of an anti-microbial protein will be produced by rabbits.An enzyme linked immunosorbant assay will be developed to study the correlation with somatic cell count or microbial infection.This study may help in early diagnosis of bovine mastitis.The assay established may also help in elevating milk quality control.牛羊乳體細胞數的增加, 主要是因為微生物的感染, 導致白血球進入乳球腔內, 混入牛羊乳中.牛羊乳含高體細胞數, 將不利於鮮乳的儲存, 也不利於乳品的加工, 因而影響牛羊乳的品質甚巨.本研究首先將分離體細胞內的嗜苯胺藍顆粒, 純化得到至少一種嗜苯胺藍顆粒內之抗菌蛋白, 免疫兔子並取得抗血清, 並建立此抗菌蛋白的酵素免疫分析法, 進而提供一種新的體細胞計數模式, 或菌相分析模式, 將可協助乳房炎的早期診斷, 同時提供牛羊乳品質的簡易鑑定方法, 以達到提升牛羊乳品質的目的