Fluorescent properties of the kindling fluorescent protein (KFP) at acidic pH values

Kindling fluorescent protein (KFP) is the photoswitchable protein which can be used in high-resolution microscopy and as a quencher in FRET-sensors. Fluorescent properties of KFP depend on pH value. In this paper we investigate the influence of pH on the spectral properties and kindling/quenching ability of KFP in the acidic pH region.Shift to the acidic region leads to the increase of fluorescence intensity of KFP over time. The excitation spectrum has a new peak near 455nm, giving two peaks - 530 and 590nm – in emission spectrum. We can assume that this maximum corresponds to the appearance of protonated form of the KFP chromophore.Analysis of fluorescence decay curves of KFP in H2O and D2O showed the presence of the kinetic isotope effect, which can be caused by the proton transfer from solvent molecules to the KFP chromophore, confirming the hypothesis that in the acidic pH region protonated form of KFP chromophore appears.At acidic pH irradiation of KFP with green light doesn’t lead to fluorescence increase, while blue light doesn’t quench the fluorescence. It means that KFP is also in the bright form, and there is no conformational states of protein which can be quenched by blue light

Сравнительный анализ протеомного профиля кератиноцитов HaCaT с использованием 1DE-гель концентрирования

Using tandem mass spectrometry with electrospray ionization, a comparative analysis of HaCaT keratinocyte proteins was carried out before and after exposure of cells to sodium dodecyl sulfate (25 mg/ml) for 48 hours; proteins encoded by human chromosome 18 genes were chosen as the comparison proteins. A total of 2418 proteins were detected in the HaCaT immortalized human keratinocytes, 70% of these proteins were identified by two or more unique peptides. Panoramic mass spectrometry analysis identified 38 proteins encoded by chromosome 18 genes, 27 proteins were common to control HaCaT cells and HaCaT cells exposed to SDS. Using the Metascape database (https://metascape.org), an enrichment analysis of GO terms of the Biological Process category of chromosome 18 gene encoded proteins of HaCaT keratinocytes was performed before and after the SDS exposure. The SDS exposure resulted in a slight enrichment of the GO term "response to stimulus" (GO:0050896) and the related GO term "negative regulation of biological process" (GO:0048519). We found decreased expression levels of membrane proteins encoded by chromosome 18 genes related to cell-cell adhesion (GO:0098609), such as DSC1, DSC3, and DSG1. A decrease in the expression level of desmosomal cadherins is characteristic of malignant neoplasms developing from epithelial tissue cells of various internal organs, mucous membranes, and skin. The method of preparation of HaCaT keratinocyte samples used in this work increased the sensitivity of proteomic analysis of cell culture and made it possible to identify twice as many proteins in one gel strip as compared to the number of proteins (1284) in HaCaT samples subjected to osmotic shock and cleavage by trypsin in solution.Проведена оценка протокола пробоподготовки образцов клеточной культуры кератиноцитов, основанного на солюбилизации белков в присутствии 0.2% додецилсульфата натрия (SDS), процедуре 1DE-гель концентрирования (SDS-PAGE без фракционирования в разделяющем геле) и расщеплении трипсином в геле для углубленного протеомного анализа кератиноцитов НаСаТ в одной полосе белка. С помощью тандемной масс-спектрометрии с электроспрейной ионизацией (LC-MS/MS) проведен сравнительный анализ белков кератиноцитов НаСаТ до и после воздействия SDS в субтоксической дозе (25 мг/мл) в течение 48 ч. В качестве белков сравнения выбраны белки, кодируемые генами хромосомы 18 человека. Всего в иммортализованных кератиноцитах человека линии НаСаТ обнаружено 2418 белков, из них около 70% идентифицировано по двум и более уникальным пептидам. По результатам панорамного масс-спектрометрического анализа удалось идентифицировать 38 белков, кодируемых генами хромосомы 18; из них 27 белков были общими для контрольных клеток и клеток НаСаТ, подвергнутых воздействию SDS. С использованием базы данных Metascape был проведен анализ обогащения терминами онтологии генов (GO) категории биологические процессы (biological process) белков хромосомы 18 кератиноцитов НаСаТ до и после воздействия SDS. Обработка клеточной культуры SDS приводила к незначительному обогащению GO термина “ответ на стимул” (GO:0050896 - response to stimulus) и связанного с ним GO термина “негативная регуляция биологических процессов” (GO:0048519 - negative regulation of biological process). Было обнаружено снижение уровня экспрессии мембранных белков, кодируемых генами хромосомы 18, относящихся к межклеточной адгезии (GO:0098609 - cell-cell adhesion), таких как DSC1, DSC3 и DSG1. Снижение уровня экспрессии десмосомальных кадгеринов характерно для злокачественных новообразований, развивающихся из клеток эпителиальной ткани различных внутренних органов, слизистых оболочек, кожи. Примененный в работе способ подготовки образцов кератиноцитов НаСаТ позволил идентифицировать в одной полосе геля в два раза больше белков по сравнению с образцами НаСаТ, подвергнутыми осмотическому шоку и расщеплению трипсином в растворе