In silico analysis of Brucella abortus Omp2b and in vitro expression of SOmp2b

Purpose At present, there is no vaccine available for the prevention of human brucellosis. Brucella outer membrane protein 2b (Omp2b) is a 36 kD porin existed in common Brucella pathogens and it is considered as priority antigen for designing a new subunit vaccine. Materials and Methods In the current study, we aimed to predict and analyze the secondary and tertiary structures of the Brucella abortus Omp2b protein, and to predict T-cell and B-cell epitopes with the help of bioinformatics tools. Subsequently, cloning and expression of the short form of Omp2b (SOmp2b) was performed using pET28a expression vector and Escherichia coli BL21 host, respectively. The recombinant SOmp2b (rSOmp2b) was purified with Ni-NTA column. Results The recombinant protein was successfully expressed in E. coli host and purified under denaturation conditions. The yield of the purified rSOmp2b was estimated by Bradford method and found to be 220 µg/mL of the culture. Conclusion Our results indicate that Omp2b protein has a potential to induce both B-cell– and T-cell–mediated immune responses and it can be evaluated as a new subunit vaccine candidate against brucellosis. Keywords: Brucella; Omp2b; In silico approach; Epitope prediction; Protein expressio

کلون ، بیان و تخلیص فرم کوتاه شده پروتئین نوترکیب Omp2b از بروسلا آبورتوس

چکیده هدف: بروسلوز جز بیماری های مشترک بین انسان و دام بوده و سالانه خسارت های فراوانی را به بهداشت جامعه و صنعت دامپروری وارد می سازد. با توجه به تلاش های متعددی که تا به حال در جهت جلوگیری از گسترش این پاتوژن به عمل آمده، اما همچنان شاهد گسترش آن در کشورهای مختلف جهان هستیم. امروزه واکسن های حیوانی متعددی برای ایمن ساختن گله های دامی در دسترس قرار دارد. عدم موفقیت قطعی این تلاش ها در متوقف ساختن این پاتوژن محققین را به پیدا کردن راهی نوین در نایل آمدن به این هدف واداشته است. با توجه به نقش مهم پروتئین های غشاء خارجی باکتری بروسلا آبورتوس در ایجاد ایمنی در بدن میزبان، تحقیقات متعددی بر روی این پروتئین ها صورت گرفته است هدف این مطالعه بررسی بیان فرم truncated پروتئین نوترکیبOmp2b در E. coli و سعی در تایید استفاده از فرم truncated این آنتی ژن به منظور ایمنی زایی بهتر در تحقیقات بعدی است. مواد و روش ها: در این تحقیق ابتداً، مطالعات بیوانفورماتیک به منظور انتخاب آنتی ژن های حفاظت شده انجام گرفت و براساس آن با استفاده از سرویس BLAST-P آنتی ژن های Omp2b حفاظت شده بین سویه های مختلف بروسلا آبورتوس بررسی و انتخاب گشت. فرم کوتاه شده ای از آنتی ژن Omp2b(TOmp2b) با توجه به اپی توپ های با اتصال قوی به MHC II که در سویه های مختلف حفاظت شده اند طراحی گشت. فرم کوتاه شده ی توالی پروتئینی به دست آمده با استفاده از I-TASSER server مدل سازی گشت. بر اساس توالی مربوطه پرایمرهایی جهت تکثیر ژن TOmp2b طراحی شدند. DNA سویه ی استاندارد بروسلا آبورتوس 544 جهت تکثیر ژن TOmp2b استخراج گردیده، سپس با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر شد. ژن TOmp2b در وکتور پلاسمیدی pET28a کلونگشت. ساختارpET28a-TOmp2b به E. coli TOP10 ترانسفورم گشته و فرایند ترانسفورماسیون با روش Colony-PCR تائید شد. به منظور بیان پروتئین نوترکیب، pET28a-TOmp2b به E. coli BL21 (DE3) منتقل گردید و با استفاده از القاگر IPTG بیان پروتئین نوترکیب تحریک گشت. خصوصیات پروتئین نوترکیب با روش های SDS-PAGE و Western blotting مورد بررسی قرار گرفت. میزان پروتئین بیان شده با استفاده از روش برادفورد اندازه گیری شد. نتایج: بیان پروتئین نوترکیب TOmp2b در سویه حاوی این قطعه در پلاسمید pET28a با استفاده از mmol 0.2 القاگر IPTG مشاهده گردید. میزان پروتئین بیان شده پس از تخلیص با استفاده از روش برادفورد 250 میکروگرم در هر میلی لیتر از محیط کشت اندازه گیری شد. خصوصیات پروتئین نوترکیب با روش های SDS-PAGE و Western blotting مورد بررسی قرار گرفت که این پروتئین مطابق بر داده های بیوانفورماتیک kD 36.6 وزن داشت. بحث: استفاده از فرم truncatedژن Omp2b با حذف سیگنال پپتید، به بیان بیشتر پروتئین نوترکیب TOmp2b در مقایسه با مطالعات گذشته انجامید. همچنین، با در نظر داشتن خصوصیات آنتی ژنیک و محافظت کنندگی پروتئین Omp2b انتظار می رود که TOmp2b همان خصوصیات پروتئین وحشی را داشته باشد. بنابر نتایج بدست آمده و مطالعات اخیر بیان پروتئین نوترکیب TOmp2b راه را برای مطالعات ساخت واکسن در آینده هموار کند