Phosphatidylserine-mediated phagocytosis of anticancer drug-treated cells by macrophages

金沢大学医薬保健研究域薬学系Apoptotic cells are rapidly phagocytosed and eliminated from the organism. Although cancer cells apoptose when treated with anticancer drugs, how those cells are recognized by phagocytic cells has remained unclear. The human leukemia cell line Jurkat was cultured with doxorubicin or bufalin and induced to undergo apoptosis accompanied by phosphatidylserine externalization. When apoptotic Jurkat cells were mixed with mouse peritoneal macrophages, efficient phagocytosis was observed. Apoptosis and phagocytosis of Jurkat cells were both inhibited by Z-VAD-FMK, and phagocytosis was significantly reduced in the presence of phosphatidylserine-containing liposomes. These results suggest that anticancer drugs induce apoptosis- dependent and phosphatidylserine-mediated phagocytosis in cancer cells

Independence of plasma membrane blebbing from other biochemical and biological characteristics of apoptotic cells

金沢大学医薬保健研究域薬学系Plasma membrane blebs are observed in many types of apoptotic cells, but their physiological roles remain to be clarified. We examined whether there is a causative connection between membrane blebbing and other apoptotic changes in Jurkat cells induced to undergo apoptosis by doxorubicin in the presence or absence of Y-27632, an inhibitor of the Rho kinase ROCK-I. The inclusion of the drug made most membrane blebs disappear, while other changes, such as chromatin condensation, inactivation of mitochondrial enzymes, externalization of the membrane phospholipid phosphatidylserine, and removal of cell surface sialic acid, remained unaffected. Furthermore, these apoptotic cells were phagocytosed by macrophages as efficiently as normally apoptosing cells. These results indicate that blebbing of the plasma membrane occurs independently from other apoptotic changes and is not involved in the recognition and engulfment of apoptotic cells by macrophages

細胞性因子によるウイルス遺伝子の転写と複製の調節機構の解析

金沢大学薬学部この研究ではNF-1と呼ばれる細胞性のタンパクによるヒトアデノウイルス遺伝子の転写と複製の調節機構を解析した。その結果以下に述べるいくつかの新しい知見が得られた。しかしながらNF-1を完全に精製するには至らなかったため、当初の計画にある精製したタンパクを用いた実験を行うことはできなかった。1.アデノウイルスの癌遺伝子産物であるE1AタンパクがNF-1のDNA結合性を低下させることが示唆された。そしてその働きは発癌性の強いアデノウイルスのE1Aタンパクで特に顕著であると思われた。これはE1AタンパクがNF-1を修飾するか、あるいは両タンパクが結合することにより引き起こされると予想される。2.NF-1のDNA結合活性は、NF-1結合部位近傍に結合する別の因子の存在により阻害されることが分かった。両因子が結合することにより互いにタ-ゲットDNAへの結合を阻害しあうと考えられた。3.DNAアフィニティ-カラム等を利用してエ-ルリッヒ腹水癌細胞の核抽出液からNF-1様因子を部分精製した。精製を進めると分子量約8万および5万ダルトンの2種類のタンパクが濃縮されてくることにより、このいずれかのタンパクがNF-1と同一のDNA結合活性を担っていると考えられた。以上の結果はE1AタンパクがNF-1活性を阻害することにより、自己遺伝子の転写とウイルスゲノムの複製を低下させることを示唆する。これはアデノウイルスの感染をきっかけとした生体組織の癌化におけるE1Aタンパクの働きを理解するうえできわめて重要な知見であると思われる。今後精製したタンパクを用いて両者の相互作用を解析することが重要である。研究課題/領域番号:01580186, 研究期間(年度):1989出典：研究課題「細胞性因子によるウイルス遺伝子の転写と複製の調節機構の解析」課題番号01580186（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-01580186/）を加工して作

Double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) fused to green fluorescent protein induces apoptosis of human embryonic kidney cells: Possible role in the Fas signaling pathway

金沢大学医薬保健研究域薬学系PKR is an interferon-inducible, double-stranded (ds) RNA-activated serine/threonine protein kinase, and has been shown to play roles in viral pathogenesis, cell growth and apoptosis. We expressed PKR as a fusion protein with enhanced jellyfish green fluorescence protein (EGFP) in human embryonic kidney 293 cells to visualize the effect of PKR transfection. The EGFP-fusion construct with wild-type PKR showed both auto- and substrate-phosphorylation activities independent of dsRNA, indicating EGFP-PKR is constitutively active. The EGFP-construct with a mutant PKR with the first RNA binding domain deleted still possessed kinase activities. On the other hand, the EGFP-fusion with a catalytically inactive mutant of PKR with the substitution of K at 296 with R, which has been shown to have tumorigenic properties, did not possess kinase activities. Transfection of the constitutive active forms of EGFP-PKR constructs induced apoptosis in 293 cells without dsRNA, whereas the EGFP-fusion with the catalytically inactive mutant did not cause apoptosis but rather protected cells from Fas-induced cell death. In addition, Fas-stimulation increased endogenous PKR activities. These results constitute evidence that PKR is sufficient to induce apoptosis, and plays a role in Fas-mediated apoptosis

細胞性因子による腫瘍ウイルスDNAの転写と複製の調節機構

金沢大学薬学系細胞性因子によるアデノウイルス12型(Ad12)DNAの転写と複製の調節機構について以下に述べる研究成果が得られた。1.Ad12DNAの転写と複製を調節する細胞性因子の同定。(1)NFーIの同定。Ad12E1A遺伝子の2つの転写のうちD転写を特異的に促進する因子をエ-ルリッヒ腹水癌細胞の核抽出液中に見い出し、精製を行った。精製標品は48,53,55kDaの3つのペプチドを含んでいた。この因子はAd12DNAの左端を1番としたとき22番〜48番の領域に結合したが、この配列はHeLa細胞のNFーIが認識する配列と一致した。さらにこの因子は、Ad2DNAの複製開始反応とHeLaNFーIと同程度に促進した。よってこの因子はマウスNFーIであると結論された。マウスNFーIはAd12DNAの左端付近に結合することにより、転写と複製両反応を調節すると考えられる。(2)ESFー1の同定。HeLa細胞の核抽出液中に存在するESFー1と名づけた因子が、Ad12E1A遺伝子のP転写を促進することが分った。この因子はTATAボックス直前の5\u27ーTGTCAー5\u27配列に結合する。2.Ad12E1A遺伝子転写の自己調節。DNAトランスフェクションにおいて、135mRNA由来のE1Aタンパクが自己遺伝子転写を約10倍促進することが分った。12SmRNA由来のタンパクは影響を与えなかった。E1Aタンパクの作用を解析するためにAd12E1Aタンパクの大量生産を、酵母と用いた系により行った。現在まで粗抽出液中にそれらしいペプチドを検出でき、抗体による確認を行っているところである。得られたE1AタンパクとNFーI、ESFー1との相互作用を調べる予定である。Celluar factors that regulate transcription and replication of adenovirus type-12(Adl2)DNA were analyzed.1 Identification of cellular factors regulating transcription and replication of Adl2 DNA.(1) Identification of nuclear factor I (NF-I) that stimulates distal transcription of the AD12 E1A gene and replication of Ad DNA.A factor stimulating Adl2 EIA gene transcription in vitro was purified to near homogeneity from nuclear extracts of Ehrlich ascites tumor cells. A purified factor contained three peptides with molecular masses of 48, 53 and 55 kDa. This factor bound to a region located at the left end of Adl2 DNA where NF-I of, HeLa cells bound. Moreover, a purified factor stimulated replication initiation of Ad2 DNA in\u27vitro to the same extent as HeLa NF-I did. We thus concluded that a purified factor is mouse NFI. These results indicate that NF-I regulates both transcription and replication of Ad 1 2 DNA - by binding to the left end of the viral genome.(2) Identification of ESF-1 that stimulates proximal transcription of the Adl2 ElA gene.A factor stimulating proximal transcription of the Adl2 ElA gene was found in nuclear extracts of HeLa cells. This factor, designated ESF-1, recognizes a sequence 5\u27-TOTCA-3\u27 located in a region adjacent to a TATA box. Purification of ESF-I is in progress.2 Autoregulation of Adl2 EIA gene.ElA protein derived from 13S, but not 12S. MRNA stimulated transcription of its own gene in a DNA transcription assay. This indicates that Adl2 EIA gene transcription is under a positive autoregulation. To elucidate a precise mechanism for this regulation, production of ElA protein is now in progress, usinga yeast expression system.研究課題/領域番号:02680154, 研究期間(年度):1990-1991出典：「細胞性因子による腫瘍ウイルスDNAの転写と複製の調節機構」研究成果報告書　課題番号02680154(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

Phagocytic removal of cells that have become unwanted: Implications for animal development and tissue homeostasis

金沢大学医薬保健研究域薬学系Cells that have become unwanted need to be promptly, selectively, and safely removed. This is made possible by apoptosis-dependent phagocytosis, in which cells unnecessary, obstructive, or dangerous to organisms are induced to undergo apoptosis so that they are earmarked for phagocytosis. The phagocytic elimination occurs so quickly that cells with hallmarks of apoptosis are barely detectable in vivo. The removal of particular types of cells at appropriate stages of development not only contributes to the disposal of spent cells, the creation of space for morphogenesis, and the exclusion of pathogenic or noxious cells, but seems to actively control tissue renewal, tissue remodeling, tissue function, and pathogenic state. This event thus plays an indispensable role in the maintenance of animal development and tissue homeostasis. © 2011 The Authors. Journal compilation © 2011 Japanese Society of Developmental Biologists

アデノウイルスE1Aタンパクによる転写因子活性の調節機構の解析

金沢大学薬学部無細胞転写反応およびDNA-タンパク結合実験を行い、アデノウイルス12型(Ad12)E1A遺伝子の転写制御機構に関して以下の知見が得られた。1.E1A遺伝子の5\u27上流域には異なる核因子が結合する2つの領域が存在する。それぞれの領域に結合する因子は互いに他方の因子のDNAへの結合を阻害する。2.一方の結合領域(a領域)への因子の結合により、E1A遺伝子の2つの転写単位のうち一方のみが促進される。3.a領域への結合因子は、アデノウイルスゲノムDNAの複製因子であるNF-Iと同様のDNA結合活性を示す。さらに、HeLa細胞より精製したNF-Iはa領域結合因子の持つ転写促進活性を代用する。4.Ad12E1Aタンパクを産生する細胞の核抽出液中には、Ad12E1A遺伝子の転写促進活性、a領域への結合活性とも認められない。以上の実験結果から、NF-I様因子がAd12E1A遺伝子の2つの転写単位のうちの一方のみを特異的に促進することが明らかとなった。従ってAd12ゲノムDNAの複製とE1A遺伝子転写の両反応がNF-Iにより制御されると考えられる。これは腫瘍原性の無いAd2やAd5には見られない制御機構である。また、Ad12E1Aタンパクの作用によりNF-IのDNA結合活性が失われることが示唆された。これらのことは、Ad12E1AタンパクがNF-Iを介してウイルスの増殖を制御するという可能性を与える。今後は、実際にAd12E1AタンパクがNF-Iの活性を調節するかどうか、そしてNF-I活性の変動がウイルス増殖に影響を与えるかどうかを追求する必要がある。この研究を通して、アデノウイルスによるトランスフォーメーションおよび腫瘍形成機構解明のための新しい視点が提供されるものと期待される。研究課題/領域番号:63620507, 研究期間(年度):1988出典：研究課題「アデノウイルスE1Aタンパクによる転写因子活性の調節機構の解析」課題番号63620507（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-63620507/）を加工して作

精子形成過程におけるPGKアイソザイム遺伝子の転写スイッチを制御する転写因子

金沢大学薬学部1.Pgk-2遺伝子転写促進因子TAP-1ならびにPgk-1遺伝子転写抑制因子TIN-1の解析ラット精巣組織の核抽出液よりTAP-1の精製を進めているが、まだ完全精製には至っていない。また同組織のmRNA由来のcDNAライブラリーを、TAP-1結合配列を持つオリゴDNAをプローブとしてスクリーニングしている。陽性クローンが数個得られ、現在最終確認を行なっているところである。TIN-1の部分精製を行なったところ、カラムクロマトグラフィーでの挙動がTAP-1のそれと同一であった。さらに両因子は類似の塩基配列を認識してDNAに結合することがわかった。よってTAP-1とTIN-1は同一分子である可能性が生じた。そこでまずTAP-1の精製を行い,そこにTIN-1活性が含まれるかを調べることにする。2.Pgk-2サイレンサーの解析DNAトランスフェクション法によりPgk-2遺伝子の転写サイレンサー活性に必要な領域を調べたところ、_-886/_-845、_-832/_-795の2箇所に限定された。サイレンサー活性には両方の領域の存在が必要であり、それぞれには異なる因子が結合することがわかった。現在それら因子のcDNAクローニング、ならびにトランスジェニックマウスを用いたサイレンサー機能の解析を行なっている。3.Pgk遺伝子転写因子の生産と活性調節における非生殖細胞の役割筆者らが確立したラット精巣の生殖細胞と非生殖細胞の混合培養系では、部分的ではあるが精子形成が進行し、Pgk遺伝子の転写スイッチが再現される。転写制御因子の機能調節などを通じて生殖細胞の分化をサポートするシグナルや因子が、非生殖細胞であるセルトリ細胞から提供されていると思われる。そこで、両細胞を接触させずに培養したり生殖細胞を単独で培養したとき、生殖細胞の生存と分化そしてPgk遺伝子転写因子の量と活性が受ける影響を解析中である。現在まで、両細胞の接着が生殖細胞の生存と分化に必要であることを示唆する結果が得られている。研究課題/領域番号:05273206, 研究期間(年度):1993出典：研究課題「精子形成過程におけるPGKアイソザイム遺伝子の転写スイッチを制御する転写因子」課題番号05273206（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-05273206/）を加工して作

哺乳動物精子形成細胞の分化と死の調節機構の解析

金沢大学医薬保健研究域薬学系哺乳動物精子形成の全過程を通じて、精子形成細胞は精巣内体細胞のセルトリ細胞と密に接触している..この細胞接着が,精子形成細胞に精子分化を促し,さらにアポトーシスを起こした精子形成細胞のセルトリ細胞による貧食に重要だと考えられる。本研究では,上記ふたつの現象に関与する分子の機能と発現を解析した。Tpx-1の機能と発現筆者らは両細胞の接着に関わるタンパク質Tpx-1を発現法によりクローニングした。ラット精巣細胞の初代培養に抗Tpx-1抗体を添加したところ,両細胞の接着が阻害されると同時に精子形成細胞における精巣特異的な遺伝子発現誘導が低下した。Tpx-1はアミノ末端付近の疎水性アミノ酸のクラスターに依存して分泌された。構造活性相関の解析により,アミノ末端側101個のアミノ酸の領域で十分な細胞接着活性が得られることが判明した。Tpx-1のmRNAはパキテン期精母細胞でタンパクはそれよりやや遅れて生産が始まることがわかった。以上より、Tpx-1は精母細胞以降の精子形成細胞で生産されて分泌され,精子形成細胞をセルトリ細胞へ接着させて分化誘導信号を精子形成細胞へ伝える分子であると考えられた。SR-BIの機能と発現これまでの筆者らの研究により,クラスBスカベンジャーレセプタータイプI(SR-BI)はセルトリ細胞が精子形成細胞を貧食する際の受容体だと予想される。貧食反応に抗SR-BI抗体あるいはSR-BIの特異リガンドのひとつである高密度リポタンパクを添加すると,いずれの場合も貧食が阻害された。また,抗体を利用してラット精巣におけるSR-BIの発現を解析したところ,生後間もない時期からセルトリ細胞にのみ存在することがわかった。これらの結果を昨年度までの成果と合わせて考察し,SR-BIはセルトリ細胞の貧食受容体だと結論された。研究課題/領域番号:10160208, 研究期間(年度):1998出典：「哺乳動物精子形成細胞の分化と死の調節機構の解析」研究成果報告書　課題番号10160208（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10160208/)を加工して作