遺伝子操作により効果を増強したキラ-T細胞による脳腫瘍に対する養子免疫療法の開発

金沢大学医学部1)マウス神経芽細胞腫C1300にレトロウイルスベクタ-PSVX(MuγΔA)を用いてIFN-γ遺伝子を導入した腫瘍細胞の、MHCをはじめとする表面抗原の発現ならびに腫瘍細胞を皮下に接種した場合の宿主の反応を検討した。IFN-γ遺伝子が入った細胞を皮下接種すると、親株に比べ腫瘍の増大が極端に低下し、2.4x10個の細胞の接種でも生着龍は7%程度であった。腫瘍の直径で皮下腫瘍の成長をみると、親株がほぼ直線的に増大するに対してIFN-γ遺伝子をいれた腫瘍株は14-20日目に一時腫瘍増大が停止し、その時期に拒絶されるものも現れ宿主の免疫反応の活性化が示唆された。生存曲線でみてもIFN-γ遺伝子導入腫瘍担体マウスは生存日数の延長がみられた。2)次いで、マウス203gliomaに対するCTLクロ-ン、E-4、を作成し、そのCTLにretrovirus vectorを用いて、同様の方法によたマウスIFN-γcDNAを導入し、その抗腫瘍活性を増強させることを試みた。G412にて選択されたsubclone,E-γ-4,E-γ-5,E-γ-6,E-γ-7,E-γ-9を樹立した。Southerm blot法でこれらsubcloneにIFN-γ遺伝子が組み込まれていることが確認された。Cr(51) release assayでin vitroでの抗腫瘍活性を検討すると、CTL親株であるE-4に比較して、IFN-γ遺伝子を組み込んだsubline,特にE-γ-9では、killing activityは約3倍上昇していた。in vivoのWinn assayにおいても、親株であるE-4に比較して、生着率の抑制に有意の効果が認められた。3)以上の所見より、マウス神経計腫瘍のシステムにおいて、腫瘍細胞および腫瘍特異的キラ-T細胞にIFN-γ遺伝子を組み込むことが可能であり、そのことによって、抗腫瘍免疫反応をmodifyすることが可能であることが明らかとなった。このような手法が、将来的には、ヒト悪性脳腫瘍の治療にも応用できる可能性が示唆された。A mouse ihterfebon (IFN) gamma CDNA was transferred to mouse neuroblastoma cell line, C1300 of A/Jax origin, with a chimeric retrovirus containing the IFN gamma gene. Two infected subclones C-gamma-3 and C-gamma-22 were obtained as a low and a high producers, respectively. These subclones were similar to the original clone in respects of in vitro growth pattern, morphology, and antigen expression of neurofilaments, except the expression of major hisiocompatibility complex (MHC) class I antigens, which were extremely augmented at the surface expression level as well as at the transcription level, regardless the difference in amount of their IFN-gamma production. The in vivo tumorigenicity was reduced in the high producer, C-gamma-22, but not in the low producer, C-gamma-3. The in vivo tumor growth rate was suppressed in both subclones, as compared to the parental line. It was therefore suggested that the suppression of tumor formation is more closely associated with constitutive IFN-gamma production rather than the MHC antigen expression, and that the tumor growth rate is affected by the high expression of the surface antigens.As a next step, the cDNA encoding mouse IFN-gamma was transferred into a specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) clone, designated E-4, against 203-glioma (a 20- methylcholanthrene-induced glioma line of C57/BL mouse origin). The efficacy of IFN-gamma production from the exogenous gene on augumeniation of tumor targeting was confirmed. Out of five, two gene-transferred subclones constitutively produced 8 to 10 times higher amount of IFN-gamma as compared with the parental E-4. Correspondingly, these two subclones exhibited 2 to 3 times higher killing activity against 203-glioma as compared with the parental line. It was thought that tumor cells, in the vicinity of the constitutively IFN-gamma-producing CTLs, may be stimulated to induce or enhance the expression of surface antigens, including the MHC antigens as well as the tumor associated antigens relevant to immune recognition.In summary, it was hopefully suggested that retrovirus-mediated transfer of cytokine genes would be useful for a modified immunotherapy of cancer.研究課題/領域番号:62480307, 研究期間(年度):1987 – 1988出典：研究課題「遺伝子操作により効果を増強したキラ-T細胞による脳腫瘍に対する養子免疫療法の開発」課題番号62480307（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-62480307/624803071989kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

脳に特異的なマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の単離

金沢大学医学部脳特異的な細胞外マトリックスとmatrix metalloproteinasc=MMPとの相互作用調べる中で,脳内に存在するプロテオグリカン(PG)であるtestican familyが細胞膜貫通型MMP(MT1-MMP,MT3-MMP)を抑制することにより神経膠芽腫細胞の浸潤を抑制することが明らかとなった。次いで正常脳及び浸潤能の著しい神経膠芽腫組織よりRNAを抽出し,testican familyの発現量を検討したところ正常脳では高発現を認め,腫瘍組織で発現の低下が認められた。更にtestican familyの発現ベクターを作成し,様々なinvasion assayでtestican familyの浸潤抑制効果を検討している。一方で近年単離された細胞外マトリックス分解酵素であるアグリカネース-1,2を含むADAMTS (A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs) familyの神経膠腫における発現についての検討を行い,アグリカネース-2が腫瘍の組織学的悪性度を反映することが示された。アグリカネースは既に正常脳で発現することが知られており,脳固有のPG分解に関係することが示唆されている。現在アグリカネース-2の発現ベクターを作成し神経膠腫細胞株への遺伝子導入を行って浸潤能に与える影響を検討している。今後はin situ hybridization法にて組織内での局在を,また遺伝子導入した神経膠腫細胞株の実験動物への移植を計画している。PGに富んだ脳組織の中で,ある種のPGは浸潤を抑える作用があることが明らかになり,また脳内PGを特異的に分解する酵素については現在まで未知である。我々の研究は脳腫瘍の浸潤機構を解明する上で細胞外マトリックスとその分解酵素の観点から新たな知見を得ようとするものである。研究課題/領域番号:11877236, 研究期間(年度):1999 – 2000出典：研究課題「脳に特異的なマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の単離」課題番号11877236（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11877236/）を加工して作

悪性神経膠腫由来の浸潤細胞障害性T細胞が認識する脳腫瘍特異的抗原ペプチドの同定

金沢大学医薬保健研究域医学系1)腫瘍浸潤リンパ球が認識する脳腫瘍特異的抗原ペプチドの同定T細胞をもちいたcDNA発現クローニング法(Rong-Fu Wang et al, 1998, Cancer Research)を試みたが、脳腫瘍浸潤リンパ球は少なく回収が困難であったためcell line化に至らず、脳腫瘍浸潤リンパ球が認識する脳腫瘍特異的抗原の同定・単離は不可能であった。2)樹状細胞ワクチン治療の臨床応用再発悪性脳腫瘍患者10症例に対し、最も強力な抗原提示細胞である樹状細胞に腫瘍抗原を認識させ細胞性免疫反応を誘導する免疫治療(樹状細胞ワクチン治療)を行った。樹状細胞ワクチン治療を施行の際の^Cr放出細胞障害性試験では、腫瘍細胞で感作された樹状細胞により刺激された患者Tリンパ球は、培養腫瘍細胞に対し、著明な殺腫瘍効果を示した。手術時に得られた標本の免疫組織化学検討にて、樹状細胞を用いた免疫治療前および治療後における腫瘍内浸潤CD8陽性Tリンパ球数は、樹状細胞治療後は治療前に比べ約30倍に増加していた。しかし、脳の局所リンパ節と考えられる頚部リンパ節においては、CD8陽性Tリンパ球数の変化は一定の傾向を示さず、腫瘍抗原の感作が不十分な場合があると考えられた。アレルギー、自己免疫疾患等の副作用は認めず、本治療の安全性が確認された。樹状細胞ワクチン治療を行った患者7例の平均生存期間は499日であり、金沢大学におけるコントロール群の410日と比べ長い傾向を示した。(第60回日本脳神経外科総会にて発表)研究課題/領域番号:13877222, 研究期間(年度):2001 – 2002出典：「悪性神経膠腫由来の浸潤細胞障害性T細胞が認識する脳腫瘍特異的抗原ペプチドの同定」研究成果報告書　課題番号13877222（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13877222）を加工して作

悪性グリオーマにおけるケモカイン遺伝子導入発現レトロウイルスペクターの開発

金沢大学医学部従来より種々の免疫療法が試みられているが、免疫原性の低い悪性グリオーマの治癒は極めて困難と思われる。我々は、MIP-1 alphaおよびMCAFなどのケモカインをウイルスベクターによって発現させ悪性グリオーマに対するワクチン療法の可能性を検討することを目的とし、これらのベクターの開発を行った。ラットcDNAライブラリーよりPCR法にてMIP-1 alphaおよびMCAFの相補性DNAをクローン化した。組換えレトロイウイルスゲノムpLNCXを用いてCMVプロモーターにより挿入遺伝子を発現するウイルスベクターゲノムを構築し、パッケージング細胞psi-CREを用いて組換えレトロウイルスベクターを得た。さらに、pLNCXを用いてEGF受容体、MBP、calmodulin-type2、GFAP、およびCMV遺伝子などのプロモータ領域を挿入しルシフェラーゼをマーカー遺伝子とし悪性グリオーマにおいて効率良く発現を行うプロモーターについて検討を行った。さらに感染段階での特異性の検討のため、ヒトEGFの相補性DNAをパッケージング細胞BOSC23に導入しEGFキメラエンベローブを発現するパッケージング細胞の作成を行った。また、組換えアデノウイルスゲノムにラットMIP-1 alphaおよびMCAFの相補性DNAを挿入し、ヒト胎児腎細胞239に導入して組換えアデノウイルスベクターを得た。PCR法およびウェスタンブロット法にて目的挿入遺伝子の発現を確認した。また、ラット神経膠肉腫細胞9Lを9L同系ラットF344の側腹部皮下に移植し1週間後にケモカイン発現ベクターを注入し、その局所免疫反応およびCTL活性の誘導などの生理活性を検討した。MIP-1 alpha発現アデノウイルスベクターを用いた場合、皮下腫瘍におけるTリンパ球および単球の著名な集蔟が観察された。アデノウイルスベクターを用いてアデノウイルス蛋白により惹起される炎症反応と共にケモカインを発現させることにより、ラット9L腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫効果が示唆された。ケモカイン発現ウイルスベクターを用いた悪性グリオーマに対するワクチン療法が期待される。The C-C chemokines including such molecules as MIP-1alpha (macrophage inflammatory protein-1 alpha) and MCAF (monocyte chemotactic and activity factor) exhibit chemoattractant potential for monocytes and T lymphocytes. We have developed retrovirus and adenovirus vector system which allow expression of the C-C chemokines to evaluate the effect of localized secretion of the chemokines on host anti-tumor response in rat given subcutaneous innoculation of 9L gliosarcoma cells followed by virus injection in vivio. The production of MIP-1alpha by infected adenovirus did not influence the growth rate in vitro, but suppressed tumor growth when the virus is injected into 9L flank tumor of F344 rats. Histological examination of the site of injection of 9L injected with MIP-1alpha expressing adenovirus vector showed predominantly T cell infiltration. These results indicated that chemokines have potent anti-tumor activities when released at the tumor site. Our studies highlight the potential usefulness of localized chemokine secretion in inducing potent antitumor host responses.研究課題/領域番号:07557359, 研究期間(年度):1995 – 1996出典：研究課題「悪性グリオーマにおけるケモカイン遺伝子導入発現レトロウイルスペクターの開発」課題番号07557359（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-07557359/075573591996kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

Significance of volume embolization ratio as a predictor of recanalization on endovascular treatment of cerebral aneurysms with Guglielmi detachable coils

The purposes of this study are, firstly, to define the relationship between volume embolization ratio (VER) and degree of angiographical occlusion in endovascular treatment with Guglielmi detachable coils, and secondly, to examine influences of neck and dome sizes of aneurysms on the VER and the angiographical treatment result, and thirdly, to determine the relationship between the VER and the recanalization of coiled aneurysms. Fifty-two aneurysms in 46 patients were examined. VER ranged 8.1-31.9% (mean 18.5%). The mean VERs of each categories based on angiographical treatment results were 23.1% in complete occlusion, 16.1% in neck remnant and 12.2% in incomplete occlusion, respectively. The VER correlated significantly with both neck and dome size, while the angiographical treatment result was only affected by neck size. Five aneurysms showed aneurysmal recanalization among followed-up 41 aneurysms. All recanalized aneurysms were large, and their VERs were in range of 10.4-17.6%. Measurement of VER is useful to estimate the degree of occlusion objectively and to predict the aneurysmal recanalization. A small aneurysms with a small neck is relatively easy to achieve high VER and angiographical complete occlusion, with the consequence of less recanalization. On the other hand, a large aneurysm is liable to recanalize due to low VER, even if there was little filling of contrast medium in the aneurysmal cavity

Aneurysm clipping after partial endovascular embolization for ruptured cerebral aneurysms

The aim of this study was to investigate the advantages and disadvantages of a two-stage treatment for ruptured cerebral aneurysms; partial embolization in acute stage followed by clipping in chronic stage of subarachnoid hemorrhage. Between April 1997 and August 1999, twenty ruptured cerebral aneurysms were initially treated endovasculary using Guglielmi detachable coils in our institution. Among them, complete embolization could not be achieved in 6 lesions. For these lesions, subsequent clipping was added. The radiological and operative findings, and outcomes of these cases were retrospectively reviewed. In 1 case, rerupture occurred during the endovascular procedure. Rerupture was not observed in any cases in the postembolization period. In 2 cases, complications related to the clipping but not the endovascular procedure occurred. These complications included impaired visual acuity for unverified reasons, and memory disturbance due to sacrifice of a perforator arising from the anterior communicating artery. In 3 cases, coil extraction was needed during the clipping, because the loops of the coil extended into the residual neck. Complications related to coil extraction were not observed in these 3 cases. Acute partial embolization of ruptured aneurysm appears to be effective for the prevention of subsequent rerupture during the subacute period, in which treatment for vasospasm should be performed, and the clipping procedure. However, in the case of relatively large aneurysms, small arteries or other normal structures behind the aneurysm cannot be observed directly during surgery, because of the immovability of the embolized aneurysm. Further, complete clip closure is impossible when loops of coil herniate into the neck. In such situations, coil extraction with or without resection of the aneurysm might be necessary, and care must be taken not to damage parent artery and surrounding vessels

Ocular dominance affects magnitude of dipole moment: An MEG study

横浜栄共済病院脳卒中診療科・脳神経外科To investigate whether the ocular dominance affects laterality in the activity of the primary visual cortex, we examined the relationship between the ocular dominance and latency or dipole moment measured by checkerboard-pattern and magnetoencephalography in 11 right-handed healthy male participants. Participants with left-eye dominance showed a dipole moment of 21.5±6.1 nAm with left-eye stimulation and 16.1±3.6 nAm with right, whereas those with right-eye dominance showed a dipole moment of 18.0±5.2 and 21.5±2.7 nAm with left-eye and right-eye stimulation of the infero-medial quadrant visual field, respectively. Thus, the dipole moment was higher when the dominant eye was stimulated, which implies that ocular dominance is regulated by the ipsilateral occipital lobe. © 2010 Wolters Kluwer Health | Lippincott Williams & Wilkins

アンチジーン発現ベクターを用いた悪性グリオーマに対する遺伝子療法

金沢大学医薬保健研究域医学系Anti-gene is a potent inhibitor of transcriptional promoter activity and subsequent gene expression. Since the number of copies of DNA is much fewer than those of transcribed mRNA,anti-gene oligonucleotides targeted against the promoter region would have an advantage over antisense oligonucleotides with an mRNA as a target. This property has been exploited to suppress the expression of a variety of oncogenes for regulating tumor proliferation or viral activities. We developed a novel retroviral vector designed to express human c-erb Banti-gene RNA and to reduce the promoter activity in the cells. Mouse fibroblast NIH3T3 cells were stably transfected with an expression construct containing a truncated human c-erb B gene promoter fused to the firefly luciferase reporter gene. Addition to these cells of the c-erb B anti-gene retroviral vector targeted to the 26 bp pyrimidine-rich element in the human c-erb B gene promoter resulted in a dose-dependent decrease in the luciferase activity of the cells. The results suggest that the reduction of the luciferase activity is due to the effect of the transcribed human c-erb B anti-gene RNA on initiation of transcription of the luciferase gene. The anti-gene RNA produced by a retroviral vector is expected to suppress the expression of an appropriate oncogene and to retard the growth of tumor cells in vivo.従来よりわれわれは、c-erbB遺伝子のプロモーター領域に作用するアンチジーン合成DNAを作成し分子間三重鎖DNAの形成を試み、転写抑制によるc-erbB遺伝子発現抑制効果を検討してきた。c-erbB遺伝子のプロモーター領域のSP-1結合部位とCAP部位を含む26bpの領域を標的とした場合に低濃度の合成DNAで遺伝子の発現抑制が示され、これらの効果を報告してきた。この方法においては代謝、毒性に関して顕著な問題はないとされているが、腫瘍性疾患に対してはどのようにして効率良く発現させるかについてさらに工夫が必要であった。ウイルスベクターにより発現されるアンチジーンRNAの転写阻害効果については従来報告がなく、その効果を検討するため、組み換えレトロウイルスベクターを構築しin vitroでの転写阻害について検討した。CMVプロモーターによりc-erbBアンチジーンを発現するウイルスベクターゲノムpLNCAを構築し、パッケージング細胞psi-CREを用いてアンチジーンレトロウイルスベクターLNCAを得た。一方、EGFRプロモーターにてルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターゲノムpLNELをマウス繊維芽細胞NIH3T3に導入し、この遺伝子組換え体細胞にウイルスベクターLNCAの反復感染を行い経時的にルシフェラーゼ酵素活性の測定を行った。LNCA感染後48時間で量依存性に酵素活性が減少し、MOI=10の条件下にて約50%のルシフェラーゼ発現阻害効果が認められた。レトロウイルスベクターにより発現されるアンチジーンRNAにより、オリゴヌクレオチドと同様に転写阻害効果が得られることが示唆された。転写阻害に必要な力価やウイルスの投与時期などの条件についてさらに検討中である。研究課題/領域番号:07457310, 研究期間(年度):1995-1996出典：研究課題「アンチジーン発現ベクターを用いた悪性グリオーマに対する遺伝子療法」課題番号07457310（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-07457310/074573101996kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作