Stressor induced ecotoxicological effects and changes of gene expression of Chironomus riparius

Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.The effects of abiotic stressors and substances of different pollutant classes on life cycle parameters and gene expression of Chironomus riparius were investigated. The goal was to develop a screening method based on a DNA microarray („ChiroChip“). The ChiroChip is the first known microarray with cDNA of chironomids. The most sensitive life cycle parameters for all substances with significant differences to the controls were mortality, the percentage of fertile egg masses, the mean female emergence time as well as the dry weight of the males. Temperature changes of ± 6°C compared to a normal temperature of 20°C lead to highly significant effects in all parameters. A LC10 was only calculable for salinity (0.66‰, CI: 0.26-1.68‰). Due to non-linear concentration-response-curves an EC50 was only calculable for the mean emergence time of female midges exposed to cadmium (0.53 mg/kg, CI: 0.29-0.97 mg/kg). Although the tested substances had no immediate toxic effects, effects on development and reproduction of the population cannot be excluded. In the experiments with methyltestosterone, ethinylestradiol, carbamazepine, fluoxetine, lead and tributyltin (which also included molecular endpoints), the most sensitive life cycle parameters were mortality, the percentage of fertile egg masses, the mean female emergence time as well as the population growth rate. Carbamazepine (CBZ) retarded the emergence of the females. 10 mg CBZ/kg lead to a higher mortality, less egg masses, which were more frequently unfertile and caused a reduced population growth rate. Fluoxetine (FX) retarded the emergence of both sexes. 0.9 mg FX/kg lead to a higher mortality, less egg masses with a higher portion being unfertile and caused a reduced population growth rate. The females were smaller in the highest concentration (5.9 mg/kg). The effects of tributyltin (expressed as µg Sn/kg) were a higher mortality and a reduced population growth rate at 100 µg Sn/kg as well as a retarded female emergence. At 160 µg Sn/kg there were less egg masses, which were more frequently unfertile. Males exposed to 120 und 160 µg Sn/kg were smaller than the controls. Exposure to lead (Pb) caused a higher mortality and more unfertile egg masses at 6,5 mg/kg. Males were smaller after exposure to 0.65 mg Pb/kg and larger at 6.5 mg Pb/kg. The number of fertile egg masses per female was reduced after exposure to 3.25 and 6.5 mg Pb/kg. Midges exposed to methyltestosterone (MET) had higher survival rates and showed an earlier emergence of both sexes. Concentrations of 27 µg MET/kg and higher lead to fewer unfertile egg masses, smaller males and to higher population growth rates. An earlier emergence of both sexes as well as higher population growth rates were also found after exposure to ethinylestradiol (EE2). At a concentration of 9 µg EE2/kg the number of unfertile egg masses was reduced. Exposure of chironomid larvae to methyltestosterone, ethinylestradiol, carbamazepine, fluoxetine, lead and tributyltin lead to the differential regulation of nine (methyltestosterone) to 49 (carbamazepine) genes. During investigation of the expressed proteins it was remarkable that known stress proteins (glutathione-S-transferase or cytochrome P450) were seldom differentially regulated. Various processes were affected by a changed gene expression. An exposure to methyltestosterone lead to the impairment of only three identified biological processes while the other substances interfered with seven to eight processes. Protein and energy metabolism were the main influenced processes. Oxygen transport was impaired by all substances tested, but with different percentages compared to all influenced processes. Oxygen transport was the main process influenced by methyltestosterone (84.6%) and barely influenced after exposure to fluoxetine (10.5%). Because the gene expression of globins was affected by substances specifically, this endpoint may be implemented as biomarker for the monitoring of surface waters. Tubulin and actin were often differentially regulated after exposure to stressors — tributyltin and carbamazepine in this study, antidepressants and estrogens in others. Hence, they may also be suited as biomarkers for chemical stress. Investigations on the concentration-dependent gene expressions as well as the differential regulation of genes in untreated larvae and other life cycle stages have to be conducted before the implementation of the ChiroChip as screening instrument for chemical research and biomonitoring. Furthermore, the existing data must be verified by quantitative real time PCR and the research of the function of the expressed genes must be intensified

Kavezno izlaganje lubina (Dicentrarchus labrax) u procjeni genotoksičnog utjecaja onečišćenja

Genotoxic effects are often the earliest signs of pollution-related environmental disturbance. In this study, we used the comet assay and micronucleus test to assess DNA damage in the erythrocytes of the European sea bass (Dicentrarchus labrax) exposed to environmental pollution in situ. Fish were collected from a fi sh farm in the Trogir Bay and their cages placed at an unpolluted reference site Šolta (Nečujam Bay) and a polluted site Vranjic (Kaštela Bay) for four weeks. A group of fi sh which remained at the fi sh farm Trogir Bay were used as the second control group. Fish exposed at the Vranjic site showed a signifi cantly higher erythrocyte DNA damage, measured by the comet assay, than either control group. Micronucleus induction showed a similar gradient of DNA damage, but did not reach statistical signifi cance. Our results show that cage exposure of a marine fi sh D. labrax can be useful in environmental biomonitoring and confi rm the comet assay as a suitable tool for detecting pollution-related genotoxicity.Genotoksični učinak često je jedan od najranijih pokazatelja štetnog djelovanja onečišćenja okoliša. U ovom radu procijenjeno je oštećenje DNA u eritrocitima lubina (Dicentrarchus labrax) izloženima okolišnom onečišćenju s pomoću komet-testa i mikronukleus-testa. Lubini su prikupljeni na ribogojilištu i kavezno izloženi u periodu od četiri tjedna na dvije postaje različitog stupnja onečišćenja na jadranskoj obali: na kontrolnoj postaji Šolta (zaljev Nečujam) i na onečišćenoj postaji Vranjic (Kaštelanski zaljev). Zasebna skupina lubina skupljena na ribogojilištu poslužila je kao druga kontrola. Rezultati komet-testa pokazali su statistički značajan porast oštećenja DNA na postaji Vranjic u usporedbi s obje kontrolne postaje. Rezultati mikronukleus-testa pokazali su sličan gradijent onečišćenja, iako nisu dosegli statističku značajnost. Ovi rezultati upućuju na primjenjivost kaveznog izlaganja lubina D. labrax u biomonitoringu vodenog okoliša te potvrđuju korisnost komet-testa kao prikladne metode za detekciju genotoksičnog utjecaja onečišćenja

DNA and chromosomal damage induced in fish (Anguilla anguilla L.) by aminomethylphosphonic acid (AMPA)-the major environmental breakdown product of glyphosate

The assessment of the direct impact of breakdown products of pesticide components on aquatic wildlife is ecotoxicologically relevant, but frequently disregarded. In this context, the evaluation of the genotoxic hazard posed by aminomethylphosphonic acid (AMPA-the major natural degradation product of glyphosate) to fish emerges as a critical but unexplored issue. Hence, the main goal of the present research was to assess the AMPA genotoxic potential to fish following short-term exposures (1 and 3 days) to environmentally realistic concentrations (11.8 and 23.6 μg L(-1)), using the comet and erythrocytic nuclear abnormalities (ENA) assays, as reflecting different levels of damage, i.e. DNA and chromosomal damage, respectively. Overall, the present findings pointed out the genotoxic hazard of AMPA to fish and, subsequently, the importance of including it in future studies concerning the risk assessment of glyphosate-based herbicides in the water systems