TLR9 Mediated Tumor-Stroma Interactions in Human Papilloma Virus (HPV)-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Up-Regulate PD-L1 and PD-L2

Background: The co-inhibitory receptor PD-1 is expressed in many tumors including head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and is an important immunotherapy target. However, the role of PD-1 ligands, PD-L1, and particularly PD-L2, in the tumor-stromal cell interactions that cause a tumor-permissive environment in HNSCC is not completely understood and is the focus of our study. Methods: Expression of PD-L1 and PD-L2 was analyzed by immunohistochemistry in situ in HNSCC tumor tissue. Co-cultures were established between stromal cells (fibroblasts and macrophages) and human papilloma virus (HPV)-positive and HPV-negative HNSCC cell lines (HNSCCs) and PD-1 ligands expression was analyzed using flow cytometry. Results: PD-L1 and PD-L2 were expressed both in tumor cells and stroma in HNSCC tissue in situ. In vitro, basal expression of PD-L1 and PD-L2 was low in HNSCCs and high on fibroblasts and macrophages. Interestingly, HPV-positive but not HPV-negative HNSCCs increased the expression of both PD-1 ligands on fibroblasts upon co-culture. This effect was not observed with macrophages. Conversely, both fibroblasts and macrophages increased PD-1 ligands on HPV-positive HNSCCs, whilst this was not observed in HPV-negative HNSCCs. Crucially, we demonstrate that up-regulation of PD-L1 and PD-L2 on fibroblasts by HPV-positive HNSCCs is mediated via TLR9. Conclusions: This work demonstrates in an in vitro model that HPV-positive HNSCCs regulate PD-L1/2 expression on fibroblasts via TLR9. This may open novel avenues to modulate immune checkpoint regulator PD-1 and its ligands by targeting TLR9

FOXP3+ Tregs and B7-H1+/PD-1+ T lymphocytes co-infiltrate the tumor tissues of high-risk breast cancer patients: Implication for immunotherapy

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Recent studies have demonstrated a direct involvement of B7-H1, PD-1 and FOXP3 molecules in the immune escape of cancer. B7-H1 is an inhibitory molecule that binds to PD-1 on T lymphocytes, while FOXP3 is a marker for regulatory T cells (T_regs). We have previously demonstrated the association of B7-H1-expressing T infiltrating lymphocytes (TIL) with high-risk breast cancer patients while other studies reported the involvement of FOXP3+ T_regsas a bad prognostic factor in breast tumors. Although the co-existence between the two types of cells has been demonstrated <it>in vitro </it>and animal models, their relative infiltration and correlation with the clinicopathological parameters of cancer patients have not been well studied. Therefore, we investigated TIL-expressing the B7-H1, PD-1, and FOXP3 molecules, in the microenvironment of human breast tumors and their possible association with the progression of the disease.</p> <p>Methods</p> <p>Using immunohistochemistry, tumor sections from 62 breast cancer patients were co-stained for B7-H1, PD-1 and FOXP3 molecules and their expression was statistically correlated with factors known to be involved in the progression of the disease.</p> <p>Results</p> <p>A co-existence of B7-H1⁺T lymphocytes and FOXP3⁺T_regswas evidenced by the highly significant correlation of these molecules (<it>P </it>< .0001) and their expression by different T lymphocyte subsets was clearly demonstrated. Interestingly, concomitant presence of FOXP3⁺T_regs, B7-H1⁺and PD-1⁺TIL synergistically correlated with high histological grade (III) (<it>P </it>< .001), estrogen receptor negative status (<it>P </it>= .017), and the presence of severe lymphocytic infiltration (<it>P </it>= .022).</p> <p>Conclusion</p> <p>Accumulation of TIL-expressing such inhibitory molecules may deteriorate the immunity of high-risk breast cancer patients and this should encourage vigorous combinatorial immunotherapeutic approaches targeting T_regsand B7-H1/PD-1 molecules.</p

Die deliktsrechtliche Bedeutung des Kreislaufwirtschafts- und Abfallgesetzes (KrW-/AbfG)

Da Abfall ein schadensträchtiges Gut darstellt, stellt sich im Umgang mit ihm die Frage nach einer etwaigen zivilrechtlichen Haftung. Gegenstand dieser Arbeit ist die rechtliche Beurteilung der Frage, ob und wie das öffentlich-rechtliche KrW-/AbfG die zivilrechtliche Haftung beeinflußt. Dabei wird der Einfluß des KrW-/AbfG auf die Bestimmung der zivilrechtlichen Verkehrspflichten ebenso erörtert wie die Frage danach, welche Schutzgesetze i.S.d. § 823 Abs. 2 BGB das KrW-/AbfG enthält. Anschließend wird behandelt, welche Folgen das KrW-/AbfG für die Haftung innerhalb eines Unternehmens bzw. für den Abfallbeauftragten hat. Abschließend geht es darum, ob mit Inkrafttreten des KrW-/AbfG eine Haftung nach dem ProdHaftG für Abfall in Betracht kommt

Die deliktsrechtliche Bedeutung des Kreislaufwirtschafts- und Abfallgesetzes (KrW-/AbfG)

Da Abfall ein schadensträchtiges Gut darstellt, stellt sich im Umgang mit ihm die Frage nach einer etwaigen zivilrechtlichen Haftung. Gegenstand dieser Arbeit ist die rechtliche Beurteilung der Frage, ob und wie das öffentlich-rechtliche KrW-/AbfG die zivilrechtliche Haftung beeinflußt. Dabei wird der Einfluß des KrW-/AbfG auf die Bestimmung der zivilrechtlichen Verkehrspflichten ebenso erörtert wie die Frage danach, welche Schutzgesetze i.S.d. § 823 Abs. 2 BGB das KrW-/AbfG enthält. Anschließend wird behandelt, welche Folgen das KrW-/AbfG für die Haftung innerhalb eines Unternehmens bzw. für den Abfallbeauftragten hat. Abschließend geht es darum, ob mit Inkrafttreten des KrW-/AbfG eine Haftung nach dem ProdHaftG für Abfall in Betracht kommt

Development and analysis of a numerical model for two-phase counter-current stratified horizontal flows

Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die numerische Analyse von gegengerichteten horizontalen Wasser-Luft Strömungen. Im Besonderen werden die fließende, schießende und teilweise umgekehrte Strömung betrachtet. Diese Strömungsformen decken einen weiten Bereich an unterschiedlichen Wasser- und Luftmassenströmen ab und treten unter anderem bei der Einspeisung in den heißen Strang, wie dies bei einem Kühlmittel-verluststörfall vorkommt, auf. Die verschiedenen Strömungsformen besitzen aufgrund der unterschiedlichen Geschwindigkeiten an der Phasengrenze unterschiedlich stark angefachte und teilweise turbulente Wellenstrukturen. Aus der statistischen Betrachtung der auftretenden Wellen ist eine Differentialgleichung, welche den lokalen Gasgehaltsanteil mit der turbulenten kinetischen Energie korreliert, bekannt. Diese wird zur Beschreibung des Impulsaustausches normal zur freien Oberfläche verwendet und kann als Diffusionskraft interpretiert werden, die mit der Auftriebskraft im Gleichgewicht steht. Die einzelnen Wellen werden als Ergebnis durch einen verschmierten (diffusiven) Zweiphasenbereich beschrieben. Der Impulsaustausch in horizontaler Richtung wird an der Phasengrenze durch die wirkende Schubspannung unter Verwendung des Phasenreibungsbeiwertes berechnet. Der Phasenreibungsbeiwert wird für Strömungen mit kleiner Wellenamplitude als konstant angenommen und leitet sich aus der Modellvorstellung für raue Wände ab. Anhand der Zwei-Fluid Gleichungen wird gezeigt, dass mit zunehmender Welligkeit die turbulente Schubspannung für den Impulsaustausch an der Phasengrenze verantwortlich ist und im Phasenreibungsbeiwert berücksichtigt werden muss. Der Impulsaustausch in horizontaler und vertikaler Richtung wird als Phasenwechselwirkungsmodell bezeichnet und basiert weiterhin auf lokalen Strömungsgrößen, wie z.B. der turbulenten kinetischen Energie. Durch Ableitung der zweiphasigen Transportgleichung für die turbulente kinetische Energie entstehen aufgrund der Phasengrenze neue Terme, deren Einfluss mit Hilfe der WENKA Experimente bestimmt werden. Zur Schließung des Phasenwechselwirkungsmodells wird das k-&#949; und k-&#969; Turbulenzmodell auf zweiphasige Strömung erweitert. Die numerische Simulation der beschriebenen Modelle liefert gute Ergebnisse für die lokalen Größen wie Geschwindigkeit und turbulente kinetische Energie, wie auch für die integralen Größen, wie z.B. den Druckverlust der Luftphase und der Rückflussrate des Wassers bei teilweise umgekehrten Strömungen. Die Einspeisung in den heißen Strang wird anhand der aus den Upper Plenum Test Facility (UPTF) Experimenten gewonnen Flutkorrelation untersucht.Counter-current horizontal stratified flows are relevant in many technical applications, e.g. in open channel flows or nuclear engineering. In detail the sub-, supercritical and partially reversed flow of water and air are investigated numerically in this work. Especially the supercritical and partially reversed flow plays an important role during the injection of coolant into the hot leg and covers a wide range of air and water mass flow rates. An ordinary differential equation which describes the interaction of the wavy surface, correlating the void fraction normal to the surface with the turbulent kinetic energy, is known. This differential equation is implemented as a diffusion force counter balancing the buoyancy force to describe the momentum exchange normal to the surface. As a result the waves are described statistically represented by a smeared two phase layer. The momentum exchange in horizontal direction is modelled by the interfacial friction factor taking account of the shear stress at the interface. The interfacial friction factor is assumed to be constant for small surface waves and is derived from the modelling approach of rough walls. From the derivation of the Two-Fluid equations it is shown that with the increase of waviness the turbulent shear stress becomes more and more relevant for the horizontal momentum exchange and has to be accounted by the interfacial friction factor. The overall momentum exchange is summarised by the phase interaction model and is additionally correlated to local flow quantities like the turbulent kinetic energy. To close the phase exchange model, accurate turbulence modelling is necessary. The phase- averaging of the second moment leads to a two phase Reynolds Stress Transport equation with additional terms for production and diffusion at the interface. The influence of the interface on the additional terms is determined from the WENKA experiments. For modelling purposes of the phase exchange model only the trace of the two-phase Reynolds Stress Transport equations, which is known as the turbulent kinetic energy equation, is used. The numerical analyses for the sub-, supercritical and partially reversed flow leads to good results for the local velocity and turbulent kinetic energy. The pressure drop along the mean flow path of the air and the backflow ratio for partially reversed flow are integral quantities which agree closely with the experimental data, too. For hot leg injection the phase interaction model is compared with the known Upper Plenum Test Facility flooding correlation

The role of novel costimulatory molecules of the B7-family in immune responses

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem Teilbereich der Immunologie, der T-Zell Aktivierung, und der Fragestellung, welche Rolle die Moleküle B7-H1 und B7-H3 der B7-Familie von Kostimulationsmolekülen hierbei übernehmen. Das Ziel der Arbeit war zum einen die Rolle von B7-H1 in humanen Glioblastomen und zum anderen die Bedeutung von B7-H3 im Muskel zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro alle 12 untersuchten Gliomzelllinien sowohl B7-H1 mRNA Transkripte als auch B7-H1 Protein auf ihrer Zelloberfläche konstitutionell aufweisen. In Gegenwart von IFN-g zeigte sich eine vermehrte Expression von B7-H1 mRNA und B7-H1 Protein auf der Zelloberfläche. Auch in vivo konnte gezeigt werden, dass Glioblastome in histologischen Präparaten positiv für B7-H1 anfärbbar waren, wohingegen das umgebende normale Hirngewebe negativ hierfür war. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von B7-H1 für die Glioblastom - T-Zell - Interaktion wurden Kokulturversuche mit Gliomzellen und alloreaktiven CD4+ oder CD8+ T-Zellen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass B7-H1 auf Gliomzellen zu einer Inhibiton von CD4+ oder CD8+ T-Zellen führt, da in Gegenwart eines neutralisierenden Antikörpers gegen B7-H1 die Zytokinmengen von IFN-g, IL-2 und IL-10 im Überstand und die Expression des T-Zell-Aktivierungsmarkers CD69 auf den T-Zellen erhöht war. Somit stellt B7-H1 einen neu charakterisierten Mechanismus dar, mit dem sich Glioblastome einer Kontrolle durch das Immunsystem entziehen können. Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass B7-H3 in Zelllysaten von humanen Myoblasten vorkommt und dass es sich auf der Zelloberfläche von diesen Zellen befindet. Zur Charakterisierung der funktionellen Bedeutung dieses Moleküls im Muskel wurden Transfektanten von einer Rhabdomyosarkomzelllinie, die phänotypische Charakteristika von Muskelzellen zeigt, mittels siRNA-Technologie hergestellt. Spezifische CD8+ T-Zellen, die zuvor in Anwesenheit der kompletten Blutlymphozyten mit Wildtyp-Zellen stimuliert worden waren, wurden auf ihre zytotoxische Aktivität bei den Transfektanten getestet. In den Ergebnissen zeigte sich, dass Zellen, die wenig B7-H3 auf ihrer Zelloberfläche haben, besser von CD8+ T-Zellen lysiert werden. Dieses Ergebnis lässt den Rückschluss zu, dass B7-H3 eine inhibitorische Wirkung auf die zytotoxische Aktivität von CD8+ Effektor T-Zellen hat und somit ein neues hemmendes kostimulatorisches Molekül in der Muskel-Immunzellinteraktion darstellt.The present paper deals with the aspect of T-cell activation in the immune response and the question which role is played by the molecules B7-H1 and B7-H3 of the B7-family of costimulatory molecules. The intention was to characterize on the one hand the role of B7-H1 in human glioblastoma and on the other hand the relevance of B7-H3 in muscle. The expression and the functional activity of B7-H1 in human glioma cells were investigated in vitro and in vivo. All twelve glioma cell lines constitutively expressed B7-H1 mRNA and protein in vitro. Exposure to IFN-g strongly enhanced B7-H1 expression. Immunohistochemical analysis of malignant glioma specimens revealed in vivo strong B7-H1 expression in all samples examined, whereas no B7-H1 expression could be detected on normal brain tissues. To elucidate the functional significance of glioma cell-related B7-H1 expression, coculture experiments of glioma cells with alloreactive CD4+ and CD8+ T-cells were performed. Glioma-related B7-H1 was identified as a strong inhibitor of CD4+ as well as CD8+ T-cell activation as assessed by increased cytokine production (IFN-g, IL-2, IL-10) and expression levels of the T-cell activation marker CD69 in the presence of a neutralizing antibody against B7-H1. Thus, B7-H1 expression represents a novel mechanism by which glioma cells evade immune recognition and destruction. In the second part of the paper it was shown that B7-H3 exists in cell lysates of human myoblasts and that it is expressed on the cell surface. To further characterize the functional role of this molecule in muscle, transfectants of a rhabdomyosarcoma cell line with phenotypical characteristics of muscle cells were established using siRNA technology. Specific CD8+ T-cells primed in the presence of PBMCs and wildtype rhabdomyosarcoma cells were tested for their capability of specific lysis of the transfectants. The results showed that transfectants with low B7-H3 cell surface expression were better lysed by CD8+ T-cells. In conclusion it was demonstrated that B7-H3 has an inhibitory effect on the cytotoxic activity of CD8+ T-cells and therefore represents a new inhibitory costimulatory molecule in muscle–immune interactions